DNA甲基化和腫瘤的關系演示教學

1、精品文檔DNA甲基化與腫瘤一、DNA甲基化與基因表達5-甲基胞喀咤是天然存在的修飾堿基， 甲基化的mCpG ,在DNA雙鏈中 對稱出現(xiàn)。哺乳類動物基 因組約60 %的表達基因5'端啟動子存在未 被甲基化白Cp鳴，而啟動子區(qū)域外的Cp鳴大都為mCpG正常情況 下，非活化的X染色體、印跡基因等的啟 動子區(qū)域的CpG島為甲基化 狀態(tài)，而看家基因的 CpG島則是去甲基化狀態(tài)。 DNA甲基化狀態(tài)與基 因表達呈負相關。其調控作 用主要在轉錄水平抑制基因表達。DNA甲基化的檢測方法經(jīng)過亞硫酸鹽處理后的 DNA中胞喀咤（C）轉變 為胸腺喀咤（T），但是 甲基化的中的CpG二核甘酸C未轉變?yōu)門,而無甲基

2、化的CpG二核甘酸 則發(fā)生這種 轉變，由此可以推斷 DNAM否發(fā)生甲基化。TATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGG CCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTTAGTAT TGTTTGGTGAAATGGTACGTGTTTATAATTTTAGTTATTTAG GAGGTTGAGGTAGGAGGATTTTTTGAGTTTAGGAGTTTAA GTTTAGTTTGGGTAATATAGTTTAGTGGTTATATTAAAAAA AGTAAAATAGTCGGGCGCGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTA GTATTTTGGGAG

3、GTCGAGGCGGGTGGATTACGAGGTTAGGAGGTTGAGATTATTTTAAGGGCAAT精品文檔精品文檔DNA甲基化抑制基因轉錄的分子機制DNA雙螺旋結構的大溝為 DNA與多種轉錄因子的 作用部位，mCpG勺 甲基化胞喀咤突入大溝，抑制轉錄因子的結合而抑制轉錄。mCpG激活阻遏蛋白因子，如 DMAP、1 TSG101 Mi2等，通過阻遏蛋白因子的 作用抑制轉錄。 DNA甲基化與組蛋白乙?；难芯堪l(fā)現(xiàn)，組蛋白H&H4的賴氨酸去乙?；髱ж撾姾?，與帶正電荷的DNA結合更緊密，不利 于轉錄過程中的聚合物解聚，從而抑制基因轉錄。甲基化的 CpG結合蛋白(MeCPs)與DNA的

4、mCp酷合，并與組氨酸去乙?；?HDAC)形成 復合物共同抑制轉錄。二、DNA甲基化與腫瘤以往的研究認為癌基因激活、抑癌基因失活主要是基因突變、缺失導致的DNA序列改變。在腫瘤研究 中，檢測到許多腫瘤的重要基因并未 發(fā)生突變、缺失，基因表達的異常主要通過DNA甲基化實現(xiàn)。癌基 因的去甲基化和抑癌基因的甲基化狀態(tài)，可導致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改變是腫瘤細胞的一個重要特征。DNA甲基化狀態(tài)的改變導致基因結構和功能的異 常，與腫瘤發(fā)生的關系是近年來研究的熱點。DNA甲基化的異常與基因突變、缺失等基因組異常也有密切的關系精品文檔精品文檔甲基化異?？赡芡ㄟ^以下

5、途徑導致的基因不穩(wěn)定：DN阿基化使基因突變率升高，5-甲基胞喀咤可自發(fā)脫氨形成胸腺喀咤,這一頻率高于胞喀咤轉變?yōu)槟蚩?的頻率，并常導 致C fT突變。p53、Rb c-H-ras-1 基因中均發(fā)現(xiàn)該類型突變。 啟動子甲基化使一些重要的基因漸成失活 ，傾向基因不穩(wěn)定。腫瘤的一個重要特征是 DN隔動子局部甲基化增強的同時，基因組總甲基化水平卻低于正常細胞?；蚪M總甲基化水平低也是基因不穩(wěn)定的原因之一。三、乳腺癌中基因的甲基化1. ER基因ER的表達與否是乳腺癌激素治療的一個腫瘤標記物。ER基因啟動子和1號外顯子上分布有CpGfijo乳腺癌中ER失表達是經(jīng)常性事件，約1/3的乳腺癌患者初診時ER表

6、達陰性；相當一部分的乳腺癌患 者隨著腫瘤病情的進 展，ER由陽性變成陰性。基因組的改變，在ER基因失表達中作用不大。精品文檔精品文檔近 來的研究認為，ER基因的甲基化異常是其失活的 主要機制應用 Southern印跡雜交及MS-PCFfc研究，顯示在正常乳腺組織和ER表達陽性的腫瘤細胞株，如MCF-7 T47-D、ZR75-1均未檢測到啟動子的高甲基化，而在原發(fā)性乳腺癌和許多ER陰性的乳腺癌細胞株 MDA-MB-231MDA-MB435MDA-MB-468Hs578t中，近50 %的ER啟動子高甲 基化?？梢?，DNA甲基化在乳腺癌的ER基因失活中起著十分重要的作用。一系列乳腺“細咆株中DNA甲

7、基轉移酶1(DNMT1)的活性水平檢測結果顯示，ER陰性的乳腺癌細胞株和ER陽性的比較，DNMT1的表達水平無論RNA水平或是蛋白水平都顯著開高。ER陰性的乳腺癌DNMT在整個細胞周精品文檔精品文檔期都表達，ER陽性的細胞株則DNMT侈數(shù)出現(xiàn)于S期。2.PR基因PR基因1號外顯子上分布有CpG島。該基因編碼兩 種同源性的蛋白質 hPRa和hPRb二者的區(qū)別在于N-末端序列和生物活性。hPRb的轉錄需 要ER激活，而hPRa不必。Southern印跡雜交及MS-PCRi分析PR表達陰性的原發(fā)性乳腺癌及乳腺癌細胞株，約40%勺PR基因啟動子甲基化。應用DNMT抑制齊J 5-aza-Dc和雌激素作用

8、于PR陰性的乳腺癌細胞株MSA-MB-231, P R基因啟動子部分去甲基化且基因重新 表達。3 . BRCA1基因BRCA1基因于1994年最早報道，為具有遺傳傾向的 乳 腺癌、卵巢癌的易感基因，在乳腺癌中最主要的改變形式為等位基因雜 合型缺失和突變。目前的研究認為，在約50%勺遺傳性乳腺癌中，BRCA1 基因的可遺傳性突變 是主要的分子機制。 散發(fā)性乳腺癌病例中,BRCA1基因突變罕見。DNA甲基 化機制可以合理地解矛!散發(fā)性乳腺癌的 BRCA1 基因轉錄與翻譯水平異常。應用 Southern印跡和甲基化敏感特異單鏈構象分析法（MS-SSCAt）分析散發(fā)性乳腺癌中BRCA1基因啟動子甲基

9、化情況,1124.2%的病傷J的BRCA1基因 啟動子高度甲基化。在散發(fā)型精品文檔精品文檔乳腺癌中，甲基化改變是BRCA1基因失表達的重要機制之一。4 .上皮鈣黏附蛋白(E-cadherin)黏附分子的異常，使細胞和細胞間失去黏附作用，在腫瘤的轉移和侵潤中起關鍵作用。E-cadherin是一種重要的鈣依賴性的黏附分子，該蛋白在上皮細胞之間起著黏附及維持組織結構完整性的作用。正常上皮中該蛋白在細胞邊緣區(qū)呈強陽性 表達，而在大多數(shù)腫瘤中表達異常。該蛋白的表達與腫瘤的浸潤、轉移呈負相關。基因的突變、缺失可以解釋部分 E-cadherin失表達，但是在約50%勺原 發(fā)性乳腺癌和乳腺癌細胞株 MDAMB

10、-43即未檢測到基因的突變、缺失， 應用MS-PCRt卻發(fā)現(xiàn)E-cadherin基因5'端CpG勺高甲基化現(xiàn)象，表 明E-cadherin基因啟動子甲基化與該基因失活密 切相關。乳腺原位導 管癌中E-cadherin啟動子30%甲基化，而轉移病灶上升到 60%，提示 E-cadherin基 因的甲基化情況與腫瘤的惡性程度相關。 研究顯示口部 鱗癌淋巴結轉移細胞系的 E-cadherin的低表達和甲基化有關。5.P16INK4a/CDKN2A/MTS精品文檔精品文檔DNA甲基化在抑癌基因失活中起著重要的作用。P16INK4a編碼的蛋白是細胞周期依賴性激酶 4的抑制物(CDKI4),通過R

11、b蛋白的磷酸化/ 去磷酸化作用調節(jié)細胞G1 - S期的轉化。該基因轉錄產(chǎn)物是 P16INK4a與P19ARF兩種蛋白。P16INK4a失活存在于 大多數(shù)腫瘤中， 但是乳腺癌中純合性缺失、點突變極 低，分別為1.9淅口 1.0%。有20% 30%勺原發(fā)性乳腺 癌及乳腺癌細胞株 T47-D、HMECsZR75-1檢測到5' 端啟動子和1號外顯子的甲基化情況。在 40例浸潤性 導管癌占30液 生P16INK4a基因甲基化，與腫瘤分級、淋巴結轉移有關。6.候選抑癌基因脾酪氨酸激酶 syk啟動子甲 基化與乳腺癌發(fā)生和轉移 的關系在細胞的信號傳導途徑中，酪氨酸激酶起著很重要 的作用。syk在造血

12、細胞上廣泛表達，作為信號傳導過 程中一個影響因子而被廣泛研究。B 細胞抗原受體(BcR)激活以后，依由syk的信號傳導途徑調節(jié) B細胞 的克隆表達，分化和凋亡。磷脂酶C(PLC)- 丫 2和磷脂酰肌醇3激酶 (PI3-K)是syk的關鍵靶位。B細胞內PLC-丫 2 syk的磷酸化導致ERK 和JNK激酶活性的下降，相反，通過syk介導Akt激活可致PI3-K磷酸 化。國外 研究認為syk,在T細胞分化成熟過程中也起著很重要的作用采用。syk也可使微管的a -微管蛋白亞基磷酸化，a -微 管蛋白亞基磷酸 化有調節(jié)微管細胞骨架的功能，而微管細胞骨架是作為信號復合物裝精品文檔精品文檔配的基礎。RT-

13、PC濟口MS-PCR僉測了 40例乳腺癌組織癌旁組織及 15例乳腺纖維瘤組織中 syk基因mRNA的表達及syk基因啟動子甲基化情況。syk mRNA在乳 腺正常組織 中可檢測到，而在乳腺癌組織中檢測率很低 ，兩組差異 有 顯著意義，這表明syk mRNA的表達缺失可能與乳腺 癌的發(fā)生有關。同 時，有淋巴結轉移的乳腺癌組織的syk mRNA勺檢出率顯著低于無淋巴結轉移組，這表明syk mRNA的表達缺失可能與乳腺癌的轉移有關。研究發(fā)現(xiàn)，轉染了野生型 syk的乳腺癌細胞株有 抑制乳腺癌生長和轉 移的作用。Okamura等認為Syk基因的表達是p53依賴性的。在腫瘤 生成過程中，p53的功能喪失會

14、導致syk的活性下降，從而使腫瘤易于 生成和轉移。Carter等認為syk與HER2/neu是一對功 能相反的抑 癌/癌基因，HER2/neu的過度表達可誘導 血管內皮細胞的收縮，從而 使腫瘤細胞易于穿過血管屏障發(fā)生轉移，而syk可抑制HER2/neu的收縮血管 內皮細胞作用，從而抑制腫瘤的轉移。Mahabeleshwar等研究認為，syk通過抑制磷脂酰肌醇3 (PI-3)激酶 的活性，從而抑制腫 瘤細胞的分裂和核因子NF-k B調 節(jié)的尿激酶型-纖溶酶激活物(u-PA)的激活分泌，而u-PA的激活分泌與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展精品文檔精品文檔及轉移相關。7,乳腺癌Nm23-H1轉移抑制基因N

15、m23-H1基因的啟動子有 2個CpG 島。DNA甲基化抑制劑5-Aza-CdR,使11個乳腺癌細胞系中5個細胞 系的Nm23H1表達升高，其中3個有轉移能力。Nm23-H1表達升高的同 時細胞系體外轉移能力下降。8. hDAB2IP(人 DOC-2/DAB2 interactive protein )hDAB2IP腫瘤抑制基因是 Ras GTPase活化家族的新成員。乳腺癌、前列腺癌中，hDAB21P甲基化率高，與表達 負相關， 甲基化狀態(tài)在 hDAB2IP基因失活中起關鍵 作用。5-aza-2-deoxycytidine 處理 后，基因表達恢 復。hDAB2IP的啟動子 區(qū)分成m2a和m2

16、b。m2a區(qū)甲基化異常：25個乳腺癌細胞系中，有11 個，占44% 39個原發(fā)乳腺癌中有15個，占38%; m2b區(qū) 甲基化異 常：25個乳腺癌細胞系中，有12個，占48% 39個原發(fā)乳腺癌中有 13個，占33%。m2b區(qū)甲基化異 常和乳腺癌淋巴結轉移有關 。9.其它基因的甲基化精品文檔精品文檔14-3-3 6 基因 PHME1（human mammary epithelial 1）、RAR 2 基因（即視黃酸受體B基因）等許多關鍵的抑癌基因和生長因子調節(jié)基因的研究都肯定了 DNA甲基化異常 是基因失活的重要機制。這些基因的表達蛋白產(chǎn)物涵蓋了諸如DNA修復、細胞周期調節(jié)、 細胞生長調節(jié)、細胞間

17、黏附等各環(huán)節(jié)。Cyclin D2, RAR- ? , Twist, RASSF1A, HIN -1在乳腺原發(fā)癌及其淋巴結（25例）、骨（12例）、腦（8例）、肺轉移（10例）的配對標本中檢測 CyclinD2, RAR-? , Twist, RASSF1A, 和 HIN-1 基因的高甲基化情況。與原發(fā)癌相比，轉移癌均有甲基化率高的趨勢，其中淋巴結轉移癌HIN-1的甲基化狀況有顯著差 異，骨、腦、肺轉移癌HIN-1和 RAR?有顯著差異。轉移癌中，上述基因的低表達與其啟動子區(qū)的高甲基化相關。甲基化率高的轉移癌對甲基化抑制劑和組蛋精品文檔精品文檔白去已酰酶抑制劑治療敏感。RASSF1A, APC,

18、 DAP-kinaseRAS association domain family protein 1A (RASSF1A), adenomatous polyposis coli (APC), death-associated protein kinase (DAP-kinase)在原發(fā)導管癌和小葉癌及不同階段和等級的侵潤癌中，RASSF1A, APC, DAP-kinase的高甲基化34例標本中，32例有一個或多個基因高甲基化，占 94%。RASSF1A高 甲基化22例,占65% APC高甲基 化15例，占47% DAP-kinase高甲基化17例, 占50%Urokinase (uPA )uPA只在高轉移癌(包括乳腺癌)中表達，uPA的高表達和其啟動子低甲基化有關。S-Adenosyl-L-methionine (AdoMet)抑制去甲基化且促進甲基化，使uPA甲基化，表達降低，顯著抑制腫瘤轉移。5 '-azacytidine抑制了 AdoMet對uPA的作用。精品文檔精品文檔4 .DNA甲基化在乳腺癌診斷中的應用DNA甲基化在乳腺癌的診療中至少可在兩方面得到應用。作為臨床診斷，病程監(jiān)控的分子標志物。逆轉基因甲基化作為腫瘤治療的新方向。目前，基因甲基