中藥對鎳暴露氧化損傷抑制作用論文

1、中藥對鎳暴露氧化損傷抑制作用論文     2013-05-30 01:39        導(dǎo)讀：藥學(xué)論文畢業(yè)論文，中藥對鎳暴露氧化損傷抑制作用論文樣式參考，免費教你怎么寫，格式要求，提供大量范文樣本：              作者：呂曉云，蒲曉麗，陳        &

2、#160;         作者：呂曉云，蒲曉麗，陳靜，朱玉真，趙健雄，魏虎來 【摘要】  目的 研究灌服扶正解毒湯(FJD)后兔血清對硫酸鎳(NiSO4)暴露的人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)自由基含量及8摻腔2餐蜒蹌襤杖磷酸酶(8瞣xo瞕GTPase)表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)的16HBE細(xì)胞分別經(jīng)NiSO4暴露及NiSO4加扶正解毒湯含藥血清共同處理后，采用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)及實時熒光定量RT睵CR檢測自由基含量及8瞣xo瞕GTPase表達(dá)的變化。結(jié)果 NiSO4(800mol/L)暴露

3、的16HBE細(xì)胞，其自由基含量及8瞣xo瞕GTPase表達(dá)水平均高于NiSO4與扶正解毒湯(10%)共處理組細(xì)胞，005001，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)2%。結(jié)論 8瞣xo瞕GTPase可作為鎳暴露氧化應(yīng)激的標(biāo)記物；中藥扶正解毒湯通過清除自由基，下調(diào)8瞣xo瞕GTPase的表達(dá)，對鎳暴露氧化損傷具有顯著的抑制作用。 【關(guān)鍵詞】  扶正解毒湯本課題組多年進(jìn)行的體內(nèi)實驗及職業(yè)病研究表明，中藥扶正解毒湯(FJD)具有良好地拮抗鎳毒性的作用1，2。本文從體外途徑研究了中藥解毒湯對硫酸鎳(NiSO4)暴露的人支氣管上皮(16HBE)細(xì)胞內(nèi)自由基含量及8摻腔2餐蜒蹌襤杖磷酸酶(8瞣xo瞕GTPas

4、e)表達(dá)的影響，旨在為該復(fù)方的作用機(jī)制補(bǔ)充新的資料。1  與方法11  材料111  細(xì)胞及動物16HBE細(xì)胞(美國ATCC公司)。純種青紫蘭兔8只，雄性，體重(21±03)kg(中國蘭州生物制品研究所)，合格證號：14004，常規(guī)飼養(yǎng)。112  中藥  扶正解毒湯由紅芪、當(dāng)歸、丹參、枸杞等組成，以三蒸水煎煮，過濾、濃縮成含生藥4g/ml的溶液，高溫高壓消毒滅菌，密封，4以下儲存?zhèn)溆谩?13  主要試劑及設(shè)備  基礎(chǔ)培養(yǎng)液(MEM)培養(yǎng)基、Trizol試劑盒(美國GIBCO公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料公

5、司)；乙酰乙酸鹽2，7捕氯氫化熒光素(D399)(美國Molecular Probes公司)；ExScripRT reagent Kit及SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa公司)；TCS sp2型激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(德國Leica公司)；Smart Cycler System熒光定量PCR儀(美國PE公司)。人類human NutT homologue (hMTH1)基因PCR引物設(shè)計參照文獻(xiàn)。分別為P1：5睠TTCTCTGCGCCACTCAA3，P2：5睪AGCGGCGGTGCAGAACC3；預(yù)計擴(kuò)增片段177bp。瞐ctin引物為P1：5睺TGCGCTC

6、AGGAGCAAT3，P2：5睺TCCAGCCTTCCTTCCTGG3；預(yù)計擴(kuò)增片段223bp(寶生物工程有限公司合成)。12  方法121  扶正解毒湯血清凍干粉制備  以中藥扶正解毒湯12g/kg每天分2次給兔等體積灌胃，空白對照組予以生理鹽水(灌胃前均禁食，自由取水)，共3d。于末次灌胃后2h心臟采血，按文獻(xiàn)4方法制備扶正解毒湯血清及空白血清凍干粉。122  細(xì)胞培養(yǎng)及受試物處理  16HBE細(xì)胞用含10%小牛血清、青霉素及鏈霉素的MEM培養(yǎng)基于37，5%CO飽和濕度的中培養(yǎng)。試驗時以不含小牛血清的MEM培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)至1×10

7、4/ml，按以下分組分別處理：(1)NiSO4組：NiSO4以無血清MEM培養(yǎng)液溶解，終濃度800mol/L(預(yù)試驗中，NiSO4800mol/L時，細(xì)胞存活率驟降至60%以下，故以800mol/L作為此試驗濃度)。(2)扶正解毒湯+NiSO4組：NiSO4染毒前4h加入扶正解毒湯血清，終濃度為10%(體積分?jǐn)?shù))，再加入NiSO4(800mol/L)。(3)扶正解毒湯+NiSO4組：同時加入扶正解毒湯與NiSO4。(4)空白血清對照(簡稱空白血清)+NiSO4組：同時加入空白血清與NiSO4。終濃度均同(2)。(5)空白血清組：加入空白血清(10%)。(6)陰性對照組：MEM培養(yǎng)液。123&#

8、160; 細(xì)胞存活率檢測  以常規(guī)臺盼藍(lán)計數(shù)法檢測各組細(xì)胞存活率，每組共計數(shù)250個細(xì)胞。124  細(xì)胞內(nèi)自由基含量檢測  在加入NiSO416h后，將收集的各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，取D399(5g/ml)1ml，加至各細(xì)胞懸液中，按文獻(xiàn)5方法以激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測16HBE細(xì)胞內(nèi)自由基含量(以平均熒光強(qiáng)度表示)。125  RNA提取、cDNA合成及標(biāo)準(zhǔn)定量模板的制備  在進(jìn)行自由基含量測定的同時，另收集各組細(xì)胞，按Trizol試劑盒說明，提取各組總RNA，測定A260，A280的吸光度值，計算出RNA的含量，并按ExScript

9、TMRT reagent Kit操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,置于-80保存?zhèn)溆?。將寶生物工程有限公司?gòu)建的hMTH1及瞐ctin定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒利用各自的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，制備6個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板，分別定義為101106拷貝數(shù)/l，-20保存?zhèn)溆谩?26  SYBR Green實時定量PCR反應(yīng)  根據(jù)SYBRR Premix Ex TaqTM試劑盒說明，設(shè)定反應(yīng)擴(kuò)增條件，將6組實驗樣品與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板同時進(jìn)行PCR。重復(fù)3次。將檢測的臨界點設(shè)定在擴(kuò)增過程中，熒光信號由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)(threshold cycle,CT)作為模板

10、初始濃度的間接指標(biāo)，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板拷貝的對數(shù)相應(yīng)的CT值作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。127  8瞣xo瞕GTPase(hMTH1 mRNA)表達(dá)的相對定量分析  將得到的各組hMTH1基因及瞐ctin基因的值分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出各自的起始模板量。以瞐ctin作為參比基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行RNA校正，用hMTH1基因的定量結(jié)果除以瞐ctin定量結(jié)果即可得到校正值。以陰性對照組hMTH1 mRNA的表達(dá)量作為“1”，再根據(jù)校正值計算出其他各組的相對量，進(jìn)行組間相對量的比較。13  分析  采用SPSS 100統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析；組間差異用t及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(

11、RSD)檢驗(以RSD2%為差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。2  結(jié)果21  細(xì)胞存活率  經(jīng)臺盼藍(lán)計數(shù)，各組的細(xì)胞存活數(shù)均不低于90%，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義。22  LSCM檢測結(jié)果(表1，圖1A)  NiSO4染毒后16h，細(xì)胞D399平均熒光強(qiáng)度(自由基含量)明顯增強(qiáng)，扶正解毒湯血清與NiSO4共處理各組D399平均熒光強(qiáng)度顯著低于NiSO4組(005001)；空白血清對染鎳細(xì)胞內(nèi)自由基含量變化無影響。表1  扶正解毒湯血清對染鎳16HBE內(nèi)自由基含量變化的影響（略）注：與陰性對照組比較，a 005；與NiSO4組比較，b 005，c 001

12、    A：NiSO4組  B：扶正解毒湯+NiSO4()組   C：扶正解毒湯+NiSO4()組圖1  LSCM下16HBE細(xì)胞內(nèi)D399熒光強(qiáng)度(×40)（略）23  實時定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析  hMTH1和瞐ctin定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為-10388和-11021，r2分別為09990和09966。表明線性關(guān)系良好，在實驗濃度范圍內(nèi)能夠進(jìn)行準(zhǔn)確定量。24  扶正解毒湯血清對染鎳細(xì)胞瞣xo瞕GTPase(hMTH1 mRNA)表達(dá)的影響(表2)  與陰性對照組比

13、較，NiSO4染毒組細(xì)胞瞣xo瞕GTPase表達(dá)明顯增強(qiáng)(RSD=58%)，且空白血清對此結(jié)果無影響；而扶正解毒湯+NiSO4組、扶正解毒湯+NiSO4組細(xì)胞瞣xo瞕GTPase表達(dá)水平則明顯低于NiSO4組(RSD分別為67%，63%)。3  討論瞣xo瞕GTPase由hMTH1基因編碼，可催化DNA氧化損傷產(chǎn)物8摻腔2餐蜒蹌襤杖磷酸(瞣xo瞕GTP)的水解，從而阻止后者向DNA的錯誤摻入，減少突變。故被視為一種內(nèi)源性抗氧化、抗突變酶6，又可作為一種氧化應(yīng)激的標(biāo)記物3。鎳化合物可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等途徑產(chǎn)生一系列細(xì)胞遺傳毒性，甚至癌變7，8。本研究發(fā)現(xiàn)，NiSO4(800mol/L)

14、暴露16HBE細(xì)胞16h，其自由基含量及瞣xo瞕GTPase表達(dá)均明顯增強(qiáng)，間接證實了鎳暴露16HBE細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的存在，同時也證明了瞣xo瞕GTPase作為氧化應(yīng)激標(biāo)記物的作用。16HBE細(xì)胞經(jīng)扶正解毒湯血清與NiSO4共同處理后，其自由基明顯降低，而瞣xo瞕GTPase的表達(dá)水平則無明顯增加。提示扶正解毒湯可能通過或直接清除方式而減少染鎳細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生，發(fā)揮體外抗氧化作用，此與體內(nèi)實驗結(jié)果一致，。同時亦可認(rèn)為，扶正解毒湯與NiSO4共處理組細(xì)胞內(nèi)瞣xo瞕GTPase表達(dá)的下調(diào)，并非扶正解毒湯血清直接作用的結(jié)果，而正是由于扶正解毒湯對ROS迅速而有效的清除，使得該氧化應(yīng)激標(biāo)記物的“預(yù)警

15、”效應(yīng)處于低或不應(yīng)答狀態(tài)，從而反證了扶正解毒湯的抗氧化作用。有關(guān)扶正解毒湯抗鎳暴露氧化損傷的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。表2  不同處理組細(xì)胞hMTH1 mRNA表達(dá)的相對量比較（略）注：與陰性對照組比較，a RSD=58%；與NiSO4組比較，b RSD=67%，c RSD63% 【參考文獻(xiàn)】   1 趙健雄，寧守斌，朱玉真，等.中藥防治硫酸鎳致肝腎損傷實驗研究J.衛(wèi)生毒雜志，2004，14(4)：240-241.2 呂曉云，趙健雄，滕玉蓮.扶正解毒顆?？规嚤┞陡螕p傷31例臨床研究J.雜志，2005，46(12)：910-912.3 Frauke M,Emerich

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