流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用內(nèi)容內(nèi)容 流式細(xì)胞儀概念、原理及應(yīng)用流式細(xì)胞儀概念、原理及應(yīng)用 流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)勢流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)勢 流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（Flow CytometryFlow Cytometry）是利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)是利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)的物理、化學(xué)特性。胞或其它顆粒性物質(zhì)的物理、化學(xué)特性。同時利用熒光染料同時利用熒光染料, ,激光技術(shù)激光技術(shù), ,單抗技術(shù)以及計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展單抗技術(shù)以及計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展, ,大大提高了檢測速大大提高了檢測速度與統(tǒng)計精確性度與統(tǒng)計精確性, ,而且從同一個細(xì)胞

2、中可以同時測得多種參數(shù)而且從同一個細(xì)胞中可以同時測得多種參數(shù), ,為生物醫(yī)學(xué)與臨床檢驗學(xué)發(fā)展提供了一個全新的視角和強(qiáng)有為生物醫(yī)學(xué)與臨床檢驗學(xué)發(fā)展提供了一個全新的視角和強(qiáng)有力的手段。力的手段。 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞儀檢測流程流式細(xì)胞儀檢測流程流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)勢（分析型）流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)勢（分析型）u高速測定細(xì)胞，大樣本計數(shù)高速測定細(xì)胞，大樣本計數(shù)u檢測稀有細(xì)胞檢測稀有細(xì)胞u多參數(shù)分析多參數(shù)分析FC500 FC500 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀050001000015000Quantitative cell fluorescenceLeukemia LymphomaDendritic cellsIntr

3、acellular signal transductionIntracellular receptorsCell viabilityCell adhesionAutoimmuneStem cellOrgan transplantationCell signalingImmune functionApoptosisHIVActivationCytokinesCell DNACell surface receptors流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用檢測特性：大小、顆粒度檢測特性：大小、顆粒度 、細(xì)胞受體、細(xì)胞受體/ /分子、核酸分子、核酸 (DNA/RNA)(DNA/RNA)、蛋白、蛋白腫瘤學(xué)中

4、的應(yīng)用腫瘤學(xué)中的應(yīng)用v腫瘤免疫腫瘤免疫v腫瘤細(xì)胞周期和凋亡腫瘤細(xì)胞周期和凋亡v腫瘤干細(xì)胞的研究腫瘤干細(xì)胞的研究v血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究 天然免疫天然免疫中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞嗜酸性細(xì)胞嗜酸性細(xì)胞嗜堿性細(xì)胞嗜堿性細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞 / / 巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞樹突細(xì)胞樹突細(xì)胞: : mDCmDC - - pDCpDCNK NK 細(xì)胞細(xì)胞NKT NKT 細(xì)胞細(xì)胞 T 淋巴細(xì)胞CD5+ B CD5+ B 細(xì)胞細(xì)胞獲得性免疫獲得性免疫B B細(xì)胞細(xì)胞輔助性輔助性T T細(xì)胞細(xì)胞Th1Th1Th2Th2細(xì)胞毒細(xì)胞毒T T細(xì)胞細(xì)胞調(diào)節(jié)性調(diào)節(jié)性T T細(xì)胞細(xì)胞 淋巴細(xì)胞免疫分型淋巴細(xì)胞免疫分

5、型腫瘤細(xì)胞免疫特點腫瘤細(xì)胞免疫特點CD3CD4CD8CD4/CD8NKCIK正常正常正常正常正常正常正常正常正常正常 正常正常正常正常 正常正常 正常正常 正常正常 正常正常Th1Th2Th1Th2細(xì)胞因子分泌細(xì)胞測定細(xì)胞因子分泌細(xì)胞測定Th1Th1細(xì)胞：細(xì)胞：介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性T T細(xì)胞的細(xì)胞的生長生長和活化、巨噬細(xì)胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)。和活化、巨噬細(xì)胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)。其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致炎癥慢性遷延，器官特異性自其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病身免疫病，急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理損

6、傷。和免疫病理損傷。Th2Th2細(xì)胞細(xì)胞 ：介導(dǎo)體液免疫，促進(jìn)介導(dǎo)體液免疫，促進(jìn)B B細(xì)胞的生長、活細(xì)胞的生長、活化和分化，是化和分化，是IgG1IgG1和和IgEIgE類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致特異性過敏反應(yīng)，參與高功能亢進(jìn)將導(dǎo)致特異性過敏反應(yīng)，參與高IgEIgE綜綜合癥和嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。合癥和嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。Th1/Th2Th1/Th2漂移與腫瘤免疫漂移與腫瘤免疫腫瘤可使腫瘤可使Th1/Th2Th1/Th2平衡向平衡向Th2Th2偏移偏移, ,而而Th1/Th2Th1/Th2偏移又會促進(jìn)腫瘤偏移又會促進(jìn)腫瘤的發(fā)展的發(fā)展, ,故探討故探討Th1/Th2Th

7、1/Th2功能狀況以判斷腫瘤患者的免疫狀態(tài)可為功能狀況以判斷腫瘤患者的免疫狀態(tài)可為腫瘤生物治療提供有效的理論依據(jù)。腫瘤生物治療提供有效的理論依據(jù)。CD4+CD25+CD4+CD25+調(diào)節(jié)性調(diào)節(jié)性T T細(xì)胞細(xì)胞 調(diào)節(jié)性調(diào)節(jié)性T T細(xì)胞具有免疫抑制功能，在多種免疫性疾病中起重要的調(diào)節(jié)作用，成為近年來免疫學(xué)領(lǐng)域研究細(xì)胞具有免疫抑制功能，在多種免疫性疾病中起重要的調(diào)節(jié)作用，成為近年來免疫學(xué)領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容。的重要內(nèi)容。 許多研究表明：在實體腫瘤和血液惡性腫瘤許多研究表明：在實體腫瘤和血液惡性腫瘤患者中患者中TregTreg數(shù)目增多。數(shù)目增多。 在乳腺癌、卵巢癌、肺癌以及肝癌等多種實在乳腺癌、卵巢癌、

8、肺癌以及肝癌等多種實體腫瘤患者外周血和腫瘤局部微環(huán)境中體腫瘤患者外周血和腫瘤局部微環(huán)境中,Treg,Treg比例比例增高增高, ,且數(shù)目與患者腫瘤進(jìn)展程度和預(yù)后、生存率且數(shù)目與患者腫瘤進(jìn)展程度和預(yù)后、生存率呈負(fù)相關(guān)。呈負(fù)相關(guān)。 血液惡性腫瘤患者中血液惡性腫瘤患者中TregTreg數(shù)目呈腫瘤發(fā)展數(shù)目呈腫瘤發(fā)展階段相關(guān)性增長。但是階段相關(guān)性增長。但是,Treg,Treg增高的機(jī)制尚不清楚。增高的機(jī)制尚不清楚。 去除去除TregTreg或封閉其抑制功能，可以增強(qiáng)抗腫或封閉其抑制功能，可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。瘤免疫反應(yīng)。 化療作為一種重要的治療腫瘤的方法化療作為一種重要的治療腫瘤的方法, ,對腫對腫瘤

9、患者外周血中的瘤患者外周血中的TregTreg數(shù)目可產(chǎn)生一定影響。數(shù)目可產(chǎn)生一定影響。 化療藥物可能通過抑制腫瘤微環(huán)境中血管生化療藥物可能通過抑制腫瘤微環(huán)境中血管生成成, ,促進(jìn)促進(jìn)TregTreg凋亡凋亡, ,從而起到有效控制腫瘤的作用。從而起到有效控制腫瘤的作用。 但也有報道證明腫瘤患者接受化療后但也有報道證明腫瘤患者接受化療后, ,外周外周血中血中TregTreg數(shù)目增多。數(shù)目增多。 化療究竟對化療究竟對TregTreg會產(chǎn)生怎樣的影響會產(chǎn)生怎樣的影響, ,目前尚無定論目前尚無定論, ,有待于進(jìn)一步研究。有待于進(jìn)一步研究。 因此因此,Treg,Treg在腫瘤治療方面的應(yīng)用成為研究的熱點。

10、如何清除或逆轉(zhuǎn)在腫瘤治療方面的應(yīng)用成為研究的熱點。如何清除或逆轉(zhuǎn)TregTreg的抑制作用是腫瘤免疫治療的一的抑制作用是腫瘤免疫治療的一個關(guān)鍵問題。個關(guān)鍵問題。樹突狀細(xì)胞樹突狀細(xì)胞 (DC)(DC) DCDC控制體內(nèi)免疫和耐受的平衡控制體內(nèi)免疫和耐受的平衡 控制控制T,B T,B 細(xì)胞對可溶性抗原的反應(yīng)細(xì)胞對可溶性抗原的反應(yīng) 影響產(chǎn)生免疫球蛋白的分類影響產(chǎn)生免疫球蛋白的分類 DC DC 亞群亞群 分為分為MDC MDC 和和PDC PDC MDCMDC誘導(dǎo)免疫應(yīng)答誘導(dǎo)免疫應(yīng)答 PDCPDC誘導(dǎo)免疫耐受誘導(dǎo)免疫耐受樹突狀細(xì)胞流式分析樹突狀細(xì)胞流式分析 陰性表達(dá)抗原設(shè)門陰性表達(dá)抗原設(shè)門 Lin (

11、CD3,14,19,20,56)/HLADRLin (CD3,14,19,20,56)/HLADR組合組合 DC: LinDC: Lin-/-/HLADR+HLADR+ DCDC亞群分析亞群分析 骨髓骨髓DC:DC: CD11c CD11c+ + 外周血外周血DCDC: CD123: CD123+ + (IL3Ra) (IL3Ra) 陽性表達(dá)抗原設(shè)門陽性表達(dá)抗原設(shè)門 CD85k (ILT3) CD85k (ILT3) 陽性設(shè)門陽性設(shè)門 僅在單核巨噬細(xì)胞及僅在單核巨噬細(xì)胞及DCDC細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表達(dá) 比比HLADRHLADR表達(dá)更具特異性表達(dá)更具特異性 避免陰性設(shè)門避免陰性設(shè)門 Different

12、iation of DC subsets:Differentiation of DC subsets: 外周血外周血DCDC: CD123: CD123+ + (IL3Ra) (IL3Ra) 骨髓骨髓DCDC: CD33: CD33+ +ILT3-PEILT3-PECD14+CD16-FITCCD33-PC5CD33-PC51234骨髓骨髓DC : CD14 CD16/CD85K（ILT3）/CD33ILT3-PEILT3-PECD14+CD16-FITCCD123-PC5CD123-PC5外周外周血血DC: CD14 CD16/ CD85K（ILT3） /CD123生物免疫治療生物免疫治療

13、CIKCIK細(xì)胞細(xì)胞( (cytokine-induced killer)cytokine-induced killer)是一群以是一群以CDCD3 3+ +T T細(xì)胞為主的異質(zhì)性細(xì)胞群體，包括細(xì)胞為主的異質(zhì)性細(xì)胞群體，包括CDCD3 3+ +CDCD5656- -、CDCD3 3- -CDCD5 65 6+ +及及CDCD3 3+ +CDCD5 65 6+ +三種亞群三種亞群, , 主要效應(yīng)細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞為CDCD3 3+ +CDCD5656+ +細(xì)胞。細(xì)胞。 CIK CIK細(xì)胞來源于外周血中的細(xì)胞來源于外周血中的CDCD4 4- -CDCD8 8+ +及及CDCD4 4- -CDCD8

14、 8- -T T細(xì)胞。因其同時表達(dá)細(xì)胞。因其同時表達(dá)CDCD3 3和和CDCD5656兩種膜蛋白分兩種膜蛋白分子，故兼有子，故兼有T T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NKNK細(xì)胞非細(xì)胞非MHCMHC限制性殺瘤特點，是目前所知殺傷活性最強(qiáng)的一限制性殺瘤特點，是目前所知殺傷活性最強(qiáng)的一種免疫效應(yīng)細(xì)胞。種免疫效應(yīng)細(xì)胞。CIKCIK細(xì)胞治療過程的評價細(xì)胞治療過程的評價治療前病人免治療前病人免疫狀況評價疫狀況評價T亞群、亞群、NK、CIK、細(xì)胞、細(xì)胞因子因子是否適合做、能否能是否適合做、能否能培養(yǎng)、值得做培養(yǎng)、值得做CIK采集MNCMNC數(shù)目、純度、數(shù)目、純度、 T亞群、亞群、NK、C

15、IK數(shù)目及比例數(shù)目及比例是否達(dá)到培養(yǎng)要求、是否達(dá)到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)MNC數(shù)目、數(shù)目、 T亞群、亞群、NK、CIK數(shù)目及比例、數(shù)目及比例、CD3、CD8活化狀況活化狀況培養(yǎng)培養(yǎng)是否達(dá)標(biāo)、回輸培養(yǎng)是否達(dá)標(biāo)、回輸時機(jī)時機(jī)回輸后T亞群、亞群、NK、CIK、細(xì)胞、細(xì)胞因子因子療效評價、監(jiān)測、下療效評價、監(jiān)測、下次治療的時機(jī)次治療的時機(jī)CIKCIK治療程序治療程序FCMFCM檢測項目檢測項目意義意義CIKCIK治療前患者的免疫功能評價治療前患者的免疫功能評價評價的項目評價的項目免疫功能六項：免疫功能六項：CD3CD3、CD4CD4、CD8CD8、CD4/CD8CD4/CD8、 NKNK、 C

16、IK CIKTh1/Th2Th1/Th2細(xì)胞因子細(xì)胞因子 FCMFCM檢測的方法檢測的方法 免疫功能六項免疫功能六項 試 劑 ：試 劑 ： C D 4 5 / C D 4 / C D 8 / C D 3C D 4 5 / C D 4 / C D 8 / C D 3 、CD3/CD56/CD45CD3/CD56/CD45 標(biāo)本類型：外周抗凝血標(biāo)本類型：外周抗凝血 評價的指標(biāo)：評價的指標(biāo)：CD3%CD3%、CD4%CD4%、CD8%CD8%、NK%NK%、CIK%CIK%（也可以做絕對計數(shù)）（也可以做絕對計數(shù)）評價的意義評價的意義1 1、CIKCIK治療的適應(yīng)癥：治療的適應(yīng)癥： 除外除外T T細(xì)胞

17、相關(guān)腫瘤、有可見包塊細(xì)胞相關(guān)腫瘤、有可見包塊2 2、是否適合做、是否適合做3 3、能否培養(yǎng)、能否培養(yǎng)4 4、值不值得做、值不值得做腫瘤細(xì)胞免疫特點腫瘤細(xì)胞免疫特點CD3CD4CD8CD4/CD8NKCIK正常正常正常正常正常正常正常正常正常正常 正常正常正常正常 正常正常 正常正常 正常正常 正常正常采集物評價（培養(yǎng)體系）采集物評價（培養(yǎng)體系）評價的項目評價的項目 MNCMNC數(shù)目、純度、數(shù)目、純度、 T T亞群、亞群、NKNK、CIKCIK數(shù)目及比數(shù)目及比例例FCMFCM方法評價方法評價評價的意義評價的意義 是否達(dá)到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)是否達(dá)到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)中的監(jiān)測培養(yǎng)中的監(jiān)測評價

18、的項目評價的項目1. MNC1. MNC數(shù)目、數(shù)目、 T T亞群、亞群、NKNK、CIKCIK數(shù)目及比例、數(shù)目及比例、CD3CD3、CD8CD8活化狀況活化狀況2. 2. 培養(yǎng)體系中的細(xì)胞因子水平培養(yǎng)體系中的細(xì)胞因子水平3. 3.CIKCIK細(xì)胞質(zhì)量：壞死、凋亡狀況細(xì)胞質(zhì)量：壞死、凋亡狀況評價方法：評價方法：FCMFCM評價的意義：評價的意義：培養(yǎng)是否達(dá)標(biāo)、回輸時機(jī)培養(yǎng)是否達(dá)標(biāo)、回輸時機(jī)確定回輸時間及培養(yǎng)物是否達(dá)到要求確定回輸時間及培養(yǎng)物是否達(dá)到要求: :CIKCIK細(xì)胞一般在細(xì)胞一般在7-97-9天天要求要求: : CD3細(xì)胞大于90% CD8細(xì)胞大于60% CIK細(xì)胞 0.51 X 109

19、個時機(jī)選擇時機(jī)選擇: : 基本達(dá)標(biāo)，CD3+HLA-DR+細(xì)胞占CD3的50%左右，CD8+HLA-DR+細(xì)胞占CD8的50%左右?；剌敽蟮谋O(jiān)測回輸后的監(jiān)測謝謝！謝謝！流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)勢（分析型）流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)勢（分析型）u高速測定細(xì)胞，大樣本計數(shù)高速測定細(xì)胞，大樣本計數(shù)u檢測稀有細(xì)胞檢測稀有細(xì)胞u多參數(shù)分析多參數(shù)分析050001000015000Quantitative cell fluorescenceLeukemia LymphomaDendritic cellsIntracellular signal transductionIntracellular receptorsCell viabi

20、lityCell adhesionAutoimmuneStem cellOrgan transplantationCell signalingImmune functionApoptosisHIVActivationCytokinesCell DNACell surface receptors流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用檢測特性：大小、顆粒度檢測特性：大小、顆粒度 、細(xì)胞受體、細(xì)胞受體/ /分子、核酸分子、核酸 (DNA/RNA)(DNA/RNA)、蛋白、蛋白Th1Th2Th1Th2細(xì)胞因子分泌細(xì)胞測定細(xì)胞因子分泌細(xì)胞測定Th1Th1細(xì)胞：細(xì)胞：介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性

21、T T細(xì)胞的細(xì)胞的生長生長和活化、巨噬細(xì)胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)。和活化、巨噬細(xì)胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)。其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致炎癥慢性遷延，器官特異性自其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病身免疫病，急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理損傷。和免疫病理損傷。Th2Th2細(xì)胞細(xì)胞 ：介導(dǎo)體液免疫，促進(jìn)介導(dǎo)體液免疫，促進(jìn)B B細(xì)胞的生長、活細(xì)胞的生長、活化和分化，是化和分化，是IgG1IgG1和和IgEIgE類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致特異性過敏反應(yīng)，參與高功能亢進(jìn)將導(dǎo)致特異性過敏反應(yīng)，參與高IgEIgE綜綜合癥和嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。合癥和嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。樹突狀細(xì)胞流式分析樹突狀細(xì)胞流式分析 陰性表達(dá)抗原設(shè)門陰性表達(dá)抗原設(shè)門 Lin (CD3,14,19,20,56)/HLADRLin (CD3,14,19,20,56)/