小鼠星形膠質細胞原代培養(yǎng)及分離純化實驗方案

1、小鼠星形膠質細胞原代培養(yǎng)及分離純化實驗方案經(jīng)過相關文獻閱讀，參考了眾多對于小膠質細胞培養(yǎng)方案，對比了不同方案的利弊優(yōu)缺，整合了相對符合本實驗室條件和實驗要求的方法，如有其他變更方案，以修改后為準。1. 實驗材料與試劑剪刀、小鑷子、小毛刷、DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清、0。25，0。05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、鏈霉素、培養(yǎng)皿離心管、50 mL 細胞培養(yǎng)瓶、CO2 恒溫細胞培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、細胞板、熒光標記二抗、0。4 Trypan Blue染色液、抗小鼠OX42單克隆抗體和新生SD小鼠等 試劑配比:(1) DMEM 10：10:1DMEM， 10%FBS, 10%Hors

2、e Serum， 1 Penicillin/Streptomycin （P/S)(2) DMEM 5：5：1DMEM, 5% FBS， 5 of Horse Serum, 1 P/S(3) SERUM FREE MEDIUM +GROWTH FACTORS（DMEM/F12無血清培養(yǎng)基+生長因子）25g/ml轉鐵蛋白,10nM生物素，30 nM亞硒酸鈉，1g/ml putrescine(腐胺）,5g/ml胰島素, 20 nMhydrocortisone（氫化可的松）,20 nMprogesterone（孕激素)，1P / S+生長因子(5ng/ ml的血小板衍生生長因子PDGFAA和5ng /

3、 ml堿性成纖維細胞生長因子bFGF）胰蛋白酶/ EDTA溶液0。05%胰蛋白酶+0。02EDTA在W / O內(nèi)Ca2+ / Mg2 +的HBSSDMEM/F12 containing 25 g/ml transferrin, 10 nM biotin， 30 nM sodium selenite, 1 g/ml putrescine， 5 g/ml insulin， 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone, 1 P/S + Growth Factors （5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF）Trypsin/EDTA so

4、lution 0.05 Trypsin + 0，02 EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+· Laminar flow hood· Dissecting magnifying glass· Water bath at 37ºC· Humidified tissue culture incubator （37ºC， 5 CO2）· Sterilized microdissecting instruments： large dissecting scissors, mouse-teeth forceps， cur

5、ved forceps and fine Dumont forceps· Orbital Shaker (Boeco OS 20）· Tabletop centrifuge· 50 ml plastic conical tubes （Sarstedt， 62.547。004）· T75 cm2 tissue culture flasks with plugseal (BD Falcon, 137787)· Tissue culture plates （Falcon)· Petri dishes （Sterilin)· 30

6、m sterile nylon mesh （Saatilene, Hitech)2。實驗步驟2。1星形膠質細胞的混合培養(yǎng)取新生SD小鼠若干只（出生24h內(nèi)）,在無菌條件下斷頭， 迅速剪開顱骨， 取出腦組織至盛有冷PBS 液的培養(yǎng)皿中反復沖洗以去除血污； 再把全腦移入另一盛有PBS 液的培養(yǎng)皿中， 用小毛筆輕輕刷去腦表面的腦膜和血管， 用PBS液沖洗后剪去腦干僅留大腦半球； 用小剪刀充分剪碎腦組織, 加入比組織塊總量多3050倍的0。05%胰酶, 再移入50 mL 離心管， 用吸管反復吹打消化至肉眼觀察無明顯的腦組織團塊; 加入DMEM/F12 完全培養(yǎng)基（含10胎牛血清、100U/mL 青霉素

7、和100 ug/mL 鏈霉素） 終止消化， 再次反復吹打制成單細胞懸液, 配平， 1000 r/ min， 離心5min, 棄上清; 加定量完全培養(yǎng)液再次制成細胞懸液, 更具實驗需要接種入若干個50 mL細胞培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中， 置于5CO2 恒溫細胞培養(yǎng)箱( 37度) 培養(yǎng)； 3 h 后更換1 次培養(yǎng)液， 以后每3 d 換1 次液， 并在鏡下觀察細胞的生長和存活情況。2.2星形膠質細胞的分離和純化將培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中的混合膠質細胞上清棄去，用0。01mol/L PBS 洗2遍。用無血清培養(yǎng)基0.25%胰酶6 mL 加入培養(yǎng)瓶，37消化15 min 左右,至鏡下觀察到大部分星形細胞脫落，將含有星形

8、膠質細胞的消化液立即置于等量含10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基中止消化,1000 r/ min離心5 min，再用PBS 洗2 遍后,重懸于含10 FBS DMEM/F12 培養(yǎng)基中，種于培養(yǎng)瓶中； 將培養(yǎng)瓶置于37細胞培養(yǎng)箱穩(wěn)定貼壁1 d 后,再用37恒溫定軌搖床，200 r/min 振搖2 h;吸取上清液棄去(其中主要包括一些小膠質細胞和部分少突膠質細胞） ，貼壁細胞采用0。 25 胰酶37消化后立即置于含10 FBS DMEM/F12 培養(yǎng)基中，終止消化后，1000 r/ min離心5 min,棄上清，將沉淀細胞重懸于含10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)基,計數(shù)后調(diào)整細胞密度10

9、6 /孔接種于6 孔培養(yǎng)板中，穩(wěn)定24 h 后可用于后續(xù)實驗。2。3星形膠質細胞的免疫細胞化學染色鑒定本實驗建議選擇OX42作為小膠質細胞的標志物， 能同時反映小膠質細胞的激活狀態(tài)，以OX42抗小鼠CD11b/c抗體免疫熒光染色法鑒定星形膠質細胞.具體步驟:(1）待小膠質細胞長成片后, 取出蓋玻片， 依次用PBS液清洗3次，每次5 min, 冰丙酮固定15 min， 干燥5 min， PBS漂洗3 次； （2）特異性抗體：按照說明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置37孵育60min，進行抗體標記.（3)洗滌:1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次/15 分鐘,晾干.(4）加入熒光標記抗體，37孵育30min.1 × PBS （pH 7。4 )洗滌3次/15 分鐘，晾干。（5）封片：封片劑封片.(6）鏡檢:熒光顯微鏡下觀察,膠質細胞包質呈現(xiàn)較強黃綠色熒光，細胞核周圍尤其明顯.注意事項1、選材注意選取新生小鼠(24h內(nèi)）。取材過程盡可能保證無菌，盡量剔除腦膜及血管和海馬部分。2、注意盡可能消除腦組織表面的殘血，避免血細胞及某些血清成分對膠質細胞貼壁的影響.3、應嚴格掌握好酶的消化濃度和消化時間.4、嚴格控制膠質細胞培養(yǎng)條件。包括細胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基,生長因子，血清,抗生素）的質量，濃度。5