磁彈性無線傳感器檢測不同液體介質(zhì)中的金黃色葡萄球菌

1、磁彈性無線傳感器檢測不同液體介質(zhì)中的金黃色葡萄球菌         11-04-22 14:45:00     編輯：studa20                   作者：黃思靜 汪義杰 蔡青云 方建德【摘要】  研制了磁彈性金黃色葡萄球菌無線傳感器，用于檢測不同液體介質(zhì)中的金黃色葡萄

2、球菌。取0.2 mL一定濃度菌液加到含2 mL無菌液體介質(zhì)的檢測玻璃管中，磁彈性傳感器共振頻率隨細(xì)菌的生長而改變。通過改變牛肉膏和蛋白胨的濃度，得出傳感器在含有2×105 cells/mL金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基CM 2-2中共振頻率響應(yīng)最大。結(jié)果表明，此傳感器可以測定的金黃色葡萄球菌濃度范圍在CM 2-2中是3×1032×107cells/mL，在牛奶中是1×1042×107 cells/mL，檢出限分別是×103 cells/mL和×104 cells/mL。傳感器共振頻移大小與金黃色葡萄球菌的濃度呈線性相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)

3、在牛奶中是0.98，在培養(yǎng)基中是0.99。 【關(guān)鍵詞】  磁彈性無線傳感器； 金黃色葡萄球菌； 培養(yǎng)基； 牛奶Keywords  Magnetoelastic wireless sensor； Staphylococcus aureus(S.aureus)； ulture medium； ilk1  引言金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）是一種重要的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、心包炎等，甚至導(dǎo)致敗血癥、膿毒癥等全身感染1，因此，檢測金黃色葡萄球菌具有實(shí)際意義。目前，檢驗(yàn)該菌的方法主要有血漿凝固酶試驗(yàn)2， 檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌腸

4、毒素采用血清學(xué)反應(yīng)3、直接落射熒光濾膜技術(shù)4、生物發(fā)光法5、壓電石英晶體技術(shù)6等，這些方法中檢測器都需要與電源連接，不能進(jìn)行無線檢測。近年來，一種新型無線磁彈性傳感器得到迅速發(fā)展718。圖1a為傳感器工作原理：在外加交變磁場中，傳感器產(chǎn)生磁致伸縮。當(dāng)外加交變磁場頻率與傳感器振動(dòng)頻率相等時(shí)，傳感器產(chǎn)生共振，對(duì)應(yīng)的振動(dòng)頻率為傳感器共振頻率。當(dāng)傳感器表面性質(zhì)發(fā)生變化，其共振頻率隨之改變。其伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的磁通可由檢測線圈檢測到，從而實(shí)現(xiàn)無線傳感7。目前，這種傳感器已在遙感監(jiān)測胃液pH值8、葡萄糖濃度9、濕度10、內(nèi)毒素11、磷酸酯酶12、有機(jī)磷農(nóng)藥13、血液凝結(jié)14等方面得到廣泛應(yīng)用?；诳贵w與抗原結(jié)

5、合構(gòu)成的磁彈性免疫傳感器，用于檢測沙門氏菌15、大腸桿菌16等。還有表面無任何化學(xué)及生物修飾的磁彈性傳感器用于結(jié)核桿菌17、大腸桿菌18的生長實(shí)時(shí)檢測。本實(shí)驗(yàn)研制了一種磁彈性金黃色葡萄球菌無線傳感器，用于檢測金黃色葡萄球菌。將傳感器置于含有細(xì)菌的液體介質(zhì)中，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行實(shí)時(shí)在線定量檢測。這種無線無源磁彈性傳感器基于傳感器對(duì)溶液性質(zhì)（主要是粘度）改變的響應(yīng)，可直接檢測不同液體介質(zhì)中的金黃色葡萄球菌含量。2  實(shí)驗(yàn)部分21  儀器與試劑磁傳感器是一種帶狀非晶態(tài)鐵磁合金2826MB（Fe40Ni38Mo4B18，美國Honeywell公司），尺寸為18 mm×6 mm&#

6、215;28 m，修飾前在空氣中的共振頻率約為105 kHz； 磁彈性傳感器檢測裝置為實(shí)驗(yàn)室自制（見圖1b）； LRH-250A 型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；DSX-280A 手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；烏氏粘度計(jì)（上海申立玻璃儀器有限公司，直徑0.53 mm）；SW-CJ-1BU超凈工作臺(tái)和HHS-11-1電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， 湖南師范大學(xué)）；牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、植物胨和瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；聚氨酯（Bayhydrol 110，水性羥基聚丙烯酸分散體，美國Bayer

7、公司）；巴斯德滅菌純牛奶（當(dāng)?shù)厣痰辏?。所有試劑均為分析純，?shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。22  實(shí)驗(yàn)方法221  傳感器制備  將傳感器放入丙酮中超聲清洗20 min，再用水反復(fù)清洗3次，用氮?dú)獯蹈?；然后?0 L Bayhydrol 110均勻涂在傳感器兩面，自然干燥后放入150 烘箱中烘2 h，使傳感器表面形成一層牢固的保護(hù)膜。此膜可以防止磁片腐蝕生銹，又為細(xì)菌正常生長提供了合適的表面。圖1  傳感器測定原理(a)及裝置(b)（略）Fig.1  Sensor principle(a) and device(b)傳感器置于裝有檢測溶液的小管中，小管置

8、于恒溫水浴鍋內(nèi)，檢測裝置通過端口RS232與電腦相連來顯示和儲(chǔ)存數(shù)據(jù)（The sensor is placed within a vial containing the test solution，which is then placed inside a coil in a thermostate.The detecting device is interfaced to a computer via a RS232 port for data display and storage）。222  儲(chǔ)備培養(yǎng)基CM 1配制  大豆肉湯（Trytic Soy Broth，TSB

9、）培養(yǎng)基的成分是：胰蛋白胨3.4 g，植物胨0.6 g，葡萄糖0.5 g，K2HPO4 0.5 g，NaCl 1 g，二次蒸餾水200 mL，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.3，121 高壓滅菌20 min。將金黃色葡萄球菌接種至已滅菌的TSB中，在37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后放入冰箱，4 條件下保存?zhèn)溆?。用傳統(tǒng)平板記數(shù)法測得菌液濃度是4.6×109 cells/mL。 223  檢測培養(yǎng)基CM 2配制  營養(yǎng)肉湯（Nutrient broth，NB）培養(yǎng)基的成分是：牛肉膏1 g，蛋白胨2 g，NaCl 1 g，二次蒸餾水200 mL，用1 mol

10、/L NaOH調(diào)至pH 7.2，121 高壓滅菌20 min。CM 2-1，CM 2-2和CM 2-3分別是將標(biāo)準(zhǔn)檢測培養(yǎng)基的牛肉膏和蛋白胨濃度增加1，2和3倍。224  測量  菌液經(jīng)無菌水梯度稀釋到一定濃度，取0.2 mL加入到含2 mL無菌液體介質(zhì)的檢測玻璃管中，用棉塞塞上管口，將玻璃管插入磁傳感器檢測線圈中。檢測線圈置于37 恒溫水浴鍋中開始測量，每1 min采集數(shù)據(jù)一次，存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中。最后經(jīng)數(shù)據(jù)處理，得到傳感器共振頻移響應(yīng)曲線，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。3  結(jié)果與討論31  培養(yǎng)基濃度的影響牛肉膏和蛋白胨是影響NB培養(yǎng)基粘度的主要成分，通過改變它們

11、的濃度來改變培養(yǎng)基的粘度，分別增加到標(biāo)準(zhǔn)濃度的2，3和4倍。磁彈性傳感器在含有2×105 cells/mL金黃色葡萄球菌的不同濃度檢測培養(yǎng)基中的典型頻移響應(yīng)曲線如圖2。圖2顯示，傳感器在CM 2-2中共振頻率響應(yīng)最大，在CM 2和CM 2-1中響應(yīng)較小，說明傳感器對(duì)粘度較高的溶液共振頻移響應(yīng)較大。但并不是溶液粘度越高越好，當(dāng)物質(zhì)濃度增加3倍時(shí)，傳感器在CM 2-3中響應(yīng)反而比CM 2-2小，說明培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)含量過高不利于細(xì)菌生長，也可能是溶液粘度過高對(duì)傳感器的性能不利。因此后面的實(shí)驗(yàn)中使用CM 2-2。32  不同液體介質(zhì)中金黃色葡萄球菌的測定實(shí)驗(yàn)根據(jù)金黃色葡萄球菌在液體

12、介質(zhì)中的生長曲線對(duì)它進(jìn)行定量分析。圖3 顯示了傳感器對(duì)CM 2-2中不同濃度的金黃色葡萄球菌的典型共振頻移響應(yīng)曲線。曲線反映了細(xì)菌的3個(gè)生長階段：a復(fù)生階段  金黃色葡萄球菌恢復(fù)其生理活性，傳感器共振頻移微小增加；b指數(shù)增長階段  細(xì)菌按指數(shù)規(guī)律增殖，傳感器共振頻移顯著增加；c穩(wěn)定階段  細(xì)菌衰亡，傳感器共振頻率不再變化?？瞻浊€沒有明顯響應(yīng)，可知傳感器在空白培養(yǎng)基中，其表面的聚氨酯膜不存在非特異性吸附，也說明實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基性質(zhì)穩(wěn)定。但是傳感器的共振頻移不僅取決于培養(yǎng)基粘度的變化，而且與細(xì)菌在傳感器表面的粘附有關(guān)。細(xì)菌在傳感器表面的吸附會(huì)使共振頻率下降，需要尋找一

13、種親水膜使細(xì)菌粘附最小，從而改善傳感器的靈敏度。本實(shí)驗(yàn)中金黃色葡萄球菌對(duì)聚氨酯親水膜幾乎不存在吸附，所以由質(zhì)量引起的頻率下降可不予考慮。     11-04-22 14:45:00     編輯：studa20  圖2  磁彈性傳感器在不同濃度培養(yǎng)基中典型頻移響應(yīng)曲線（略） Fig.2  Typical frequency response curves of magnetoelastic sensor in different concentration culture medium

14、金黃色葡萄球菌濃度(Staphylococcus aureus(S.aureus) concentration): 2×105 cells/mL，CM 2.標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(tandard culture medium)； CM 2-1.2倍標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(oubling culture medium)； CM 2-2.3倍標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(rebling culture medium)； CM 2-3.4倍標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(uadrupling culture medium)。圖3  不同濃度金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)基中的典型頻移響應(yīng)曲線（略）Fig.3  Typical frequen

15、cy response curves in culture medium of different concentration of Staphylococcus aureus培養(yǎng)基(ulture medium): CM 2-2； 3倍標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(rebling culture medium)；金黃色葡萄球菌濃度(S.ureus concentration): (1) 2×107； (2) 2.4×105； (3) 3×103； (4) 0 cells/m。圖4是傳感器對(duì)金黃色葡萄球菌在牛奶中生長的共振頻移響應(yīng)曲線。該曲線反映了牛奶的分解與凝固過程。細(xì)菌的增殖分解

16、了牛奶中的大分子物質(zhì)，導(dǎo)致牛奶粘度減小，傳感器共振頻率增加。進(jìn)一步培養(yǎng)又使牛奶凝固，從而粘度顯著上升，傳感器共振頻率減小。圖4所示，細(xì)菌初始濃度越高傳感器頻率上升越快，達(dá)到最高點(diǎn)所需培養(yǎng)時(shí)間越短，即傳感器頻率開始下降的時(shí)間越短。傳感器在無菌的牛奶中共振頻移僅有所下降，是由于在37 的培養(yǎng)條件下，牛奶自身凝固。為考察牛奶粘度的變化情況，將2×107 cells/mL金黃色葡萄球菌接種到牛奶中培養(yǎng)，在25 水浴中用烏氏粘度計(jì)測定牛奶粘度。牛奶粘度從1.877 mpa·s降到1.576 mpa·s，又上升到2.037 mpa·s，所以傳感器共振頻率先增大后減小

17、。圖5顯示，傳感器共振頻移大小與金黃色葡萄球菌的濃度密切相關(guān)。金黃色葡萄球菌的濃度可以通過傳感器共振頻率的增大和減小進(jìn)行定量分析，線性范圍在牛奶中是×104×107 cells/mL，檢出限是×104 cells/mL，在培養(yǎng)基中是×103×107 cells/mL，檢出限是×103 cells/mL。圖4  不同濃度金黃色葡萄球菌在牛奶中的典型頻移響應(yīng)曲線（略）Fig.4  Typical frequency response curves in milk of different concentration of Staphylococcus aureus金黃色葡萄球菌濃度(S.aureus concentration): (1)