泡桐花總黃酮抗哮喘豚鼠氣道炎癥的作用機(jī)制探討(一)

1、泡桐花總黃酮抗哮喘豚鼠氣道炎癥的作用機(jī)制探討(一)    作者：陳保紅， 李寅超， 趙宜紅， 傅蔓華 【關(guān)鍵詞】 豚鼠；,慢性氣道變應(yīng)性炎癥；,泡桐花總黃酮摘要：目的通過(guò)豚鼠哮喘模型研究泡桐花總黃酮抗哮喘氣道變應(yīng)性炎癥的作用。 方法以卵蛋白（OA）致敏豚鼠為動(dòng)物模型，灌胃途徑予以泡桐花總黃酮大、小劑量，觀察各組豚鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞特異性趨化因子（Eotaxin）的改變。結(jié)果泡桐花總黃酮可顯著延長(zhǎng)致敏豚鼠的引喘潛伏期，不同程度地抑制BALF中的EOS和白細(xì)胞總數(shù)及氣道上皮Eotaxin的過(guò)度表

2、達(dá)。 結(jié)論泡桐花總黃酮對(duì)哮喘具有一定的保護(hù)作用，其中泡桐花總黃酮可能通過(guò)調(diào)控Eotaxin在氣道黏膜上皮的過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而抑制Eos向哮喘氣道的募集，消除氣道炎癥，成為其發(fā)揮抗過(guò)敏性哮喘的重要環(huán)節(jié)。關(guān)鍵詞：豚鼠； 慢性氣道變應(yīng)性炎癥； 泡桐花總黃酮Abstract：ObjectiveThis study was designed to investigate the effects of flavonoids in Fructus Paulowniae on IAR and LAR.MethodsAn guinea pig asthmatic model, induced by OVA was

3、administered by intragastric gavage(ig) with different doses of flavonoids in Fructus Paulowniae. The latent period, the number of acidophils and the Eotaxin in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were observed. ResultsThe flavonoids in Fructus Paulowniae could delay the latent period of airway infla

4、mmation significantly. The number of acidophils and total white blood cell in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) was restrained by flavonoids in Fructus Paulowniae. In addition, the flavonoids in Fructus Paulowniae could inhibit the overexpression of Eotaxin in the trachea epithelium.ConclusionThe r

5、esults suggest that flavonoids in Fructus Paulowniae can antagonize airway inflammation by inhibiting the overexpression of the Eotaxin in trachea epithelium.Key words：Paulounia fortunei(Semsl.)Hemsl; Flavonoids; Bronchia asthma 氣道炎癥是支氣管哮喘(asthma)的病理基礎(chǔ)，有多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與其炎癥過(guò)程1。研究發(fā)現(xiàn)2嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）趨化聚集，

6、在氣道炎癥的形成過(guò)程中起重要作用，Eotaxin是EOS的選擇性趨化劑3，也是EOS在哮喘發(fā)病過(guò)程中選擇性增加的原因。因此，調(diào)控Eotaxin的過(guò)度表達(dá)，抑制EOS在氣道內(nèi)的募集，消除氣道炎癥，對(duì)治療哮喘具有關(guān)鍵性意義。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道4，5，少常用草藥泡桐花在支氣管哮喘的臨床治療上具有一定的效果；泡桐花浸膏能夠明顯改善哮喘豚鼠肺組織的病理?yè)p傷，對(duì)哮喘豚鼠有顯著的治療作用；泡桐花主要成分6為揮發(fā)油、總黃酮、熊果酸等，其中總黃酮含量較豐富（3.081%）。我們以泡桐花總黃酮為研究對(duì)象，采用ig給藥途徑，結(jié)合圖象分析技術(shù)探討其抗哮喘作用及其機(jī)制。1 材料與方法 1.1 動(dòng)物與分組健康白化豚鼠，雌雄各半

7、，體重（200±50）g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為模型、陽(yáng)性、空白對(duì)照組和泡桐花總黃酮大、小劑量組。10只/組。1.2 藥品與試劑卵白蛋白（ovalbumin，OA）：Sigma公司，Grade；Eotaxin一抗(BA1469，Rabbit anti-Eotaxin)武漢博士德生物工程有限公司，相應(yīng)二抗試劑盒及陽(yáng)性對(duì)照片購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司；醋酸地塞米松片，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)051247。泡桐花總黃酮由鄭州大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)研究室提供。1.3 動(dòng)物誘喘及用藥參照宮兆華7方法，常規(guī)飼養(yǎng)觀察3 d無(wú)異常后，予10OA生理鹽水(N.S)溶液200 mg/kg

8、ip致敏，并于當(dāng)天開(kāi)始按表1劑量給藥。第15天時(shí)，予5%OA的N.S溶液霧化吸入誘導(dǎo)哮喘發(fā)作。用哮喘發(fā)作（動(dòng)物取出后的表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、煩躁、抽搐、跌倒甚至死亡)的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.4 用藥過(guò)程中哮喘防治作用觀察用藥第5，12天及第15天，3次對(duì)豚鼠進(jìn)行激發(fā)實(shí)驗(yàn)。予5%OA的N.S溶液霧化吸入激發(fā)10 s，封閉時(shí)間共20 s，觀察記錄各組動(dòng)物哮喘嚴(yán)重程度，取第15天的引喘潛伏期（自霧化開(kāi)始至豚鼠腹肌痙攣、腹部凹陷出現(xiàn)的時(shí)間作為引喘潛伏期，超過(guò)6 min者以360 s計(jì)算）為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。在第5，12天的激發(fā)過(guò)程中，先后有8只動(dòng)物（大、小劑量組各2只，模型組3只，陽(yáng)性組1只）因反應(yīng)劇烈，搶救不及

9、而窒息死亡。1.5 BALF（broncho alveolar lavag fluid BALF）的采集與細(xì)胞計(jì)數(shù)暴露豚鼠氣管肺，用絲線結(jié)扎右肺門處，行氣管插管灌洗左肺。灌入N.S 5 ml（抽吸2次）×2次，灌洗回收率大于80%，無(wú)菌離心（1 500 r/min×10 min），沉淀細(xì)胞以Hanks液處理后即刻在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞濃度調(diào)至2×106/ml，涂片，瑞氏染色，計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)和EOS數(shù)。1.6 免疫組化Eotaxin檢測(cè)摘取右肺中葉，放入乙醇、醋酸和甲醛混合固定液中固定48 h。石蠟切片（4 m×3張）脫蠟至水，行免疫組化Eotaxi

10、n（EOS趨化性細(xì)胞因子）染色。免疫組化操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DAB顯色。另設(shè)不加一抗的切片作陰性對(duì)照。每只動(dòng)物在細(xì)支氣管黏膜各隨機(jī)選擇5個(gè)Hot視野，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)每個(gè)Hot視野Eotaxin表達(dá)陽(yáng)性信號(hào)的積分光密度IOD，以平均值表示該動(dòng)物氣道Eotaxin陽(yáng)性表達(dá)水平。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以 ±s表示，使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。2 結(jié)果表1 泡桐花總黃酮對(duì)豚鼠引喘潛伏期的影響（略）與模型對(duì)照組比較，*P0.05， *P0.012.2 對(duì)BALF中白細(xì)胞總數(shù)與EOS計(jì)數(shù)的影響結(jié)果表明，泡桐花總黃酮大劑量和陽(yáng)性藥對(duì)BALF中白細(xì)胞總數(shù)和EOS計(jì)數(shù)有抑制作用，與

11、模型組比較，差異有極顯著性意義（P0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。表2 對(duì)BALF中白細(xì)胞總數(shù)與EOS計(jì)數(shù)的影響（略）與模型對(duì)照組比較，*P0.05，*P0.012.3 豚鼠氣道上皮表達(dá)Eotaxin陽(yáng)性蛋白信號(hào)的圖象分析鏡下Eotmin陽(yáng)性信號(hào)主要位于支氣管黏膜上皮、肺泡上皮和平滑肌細(xì)胞、肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿，內(nèi)含棕黃色顆粒物質(zhì)。圖象分析結(jié)果顯示，模型組支氣管黏膜上皮Eotaxin表達(dá)陽(yáng)性信號(hào)的IOD顯著高于空白組，差異有顯著性意義（P均0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性藥和總黃酮大劑量組表達(dá)Eotmin陽(yáng)性蛋白信號(hào)細(xì)胞的IOD明顯降低，差異有顯著性意義（P0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。表3 對(duì)豚鼠氣道Eot

12、axin 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響 （略）與模型對(duì)照組比較，*P0.05,*P0.013 討論哮喘(asthma)是一種由多種因素引起的以可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)和氣道炎癥為特征的免疫變態(tài)反應(yīng)性疾病1，2。慢性氣道炎癥是哮喘發(fā)病的一個(gè)重要因素，有多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與其炎癥過(guò)程。氣道炎癥是氣道高反應(yīng)(Bronchial Hyperresponsiveness，BHR)的基礎(chǔ)，無(wú)論過(guò)敏性還是非過(guò)敏性哮喘，氣道炎癥都以Eos的浸潤(rùn)募集和激活為最終途徑，而哮喘時(shí)異常高表達(dá)于氣道上皮的Eotaxin作為EOS高度選擇性的化學(xué)趨化劑，成為EOS在哮喘發(fā)病過(guò)程中選擇性增加的原因2。研究發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)

13、于哮喘模型動(dòng)物細(xì)支氣管黏膜的EOS數(shù)與該部位Eotaxin 陽(yáng)性表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)8。因此，調(diào)控Eotaxin的過(guò)度表達(dá)，抑制Eos在氣道內(nèi)的募集，消除氣道炎癥，對(duì)治療哮喘具有關(guān)鍵性意義。在哮喘的治療藥物中，甾體類抗炎藥糖皮質(zhì)激素等是目前較有效的藥物，但因其副作用多，不宜長(zhǎng)期使用，導(dǎo)致哮喘的控制率不盡人意，死亡率較高1。中藥成分雖然復(fù)雜，但其具有整體調(diào)節(jié)且毒副作用相對(duì)較小的優(yōu)點(diǎn)，因此，從中藥中挖掘抗炎平喘成分是未來(lái)哮喘研究的重要內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)以引喘潛伏期、EOS和Eotaxin作為觀察指標(biāo)，探討泡桐花總黃酮抗支氣管哮喘變應(yīng)性炎癥的防治作用及其可能的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，泡桐花總黃酮可顯著延長(zhǎng)致敏

14、豚鼠的引喘潛伏期，不同程度地抑制BALF中的EOS和白細(xì)胞總數(shù)及氣道上皮Eotaxin的過(guò)度表達(dá)，與模型組比較有顯著差異。給藥5 d和12 d，泡桐花總黃酮大小劑量不能預(yù)防再次吸入卵蛋白抗原后的哮喘發(fā)作，并且動(dòng)物死亡率高，這很可能是動(dòng)物對(duì)抗原敏感度高所致。給藥第15天，再次吸入卵蛋白抗原后的哮喘發(fā)作較平穩(wěn)，無(wú)死亡發(fā)生，可能與藥效發(fā)揮和免疫耐受有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，泡桐花總黃酮對(duì)哮喘具有一定的保護(hù)作用，其中泡桐花總黃酮可能通過(guò)調(diào)控Eotaxin在氣道黏膜上皮的過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而抑制Eos向哮喘氣道的募集，消除氣道炎癥，成為其發(fā)揮抗過(guò)敏性哮喘的重要環(huán)節(jié)。參考文獻(xiàn)：1 王國(guó)斌重視哮喘，正確診治和控制哮喘J.中原醫(yī)刊，2002，29（11）：40 2 Luis MTeran CCL Chemokines and asthmaJ.Immunology today，2000，21(5)：2353 劉 新，張 蘇，崔 毅豚鼠氣道炎癥中Eotaxin基因表達(dá)的意義J.微生物學(xué)雜志，2005，25（3）：33.4 全國(guó)中草藥匯編編寫(xiě)組.全國(guó)中草藥匯編M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1975：466.5 張永輝，劉宗花，杜紅麗，等中藥泡桐花浸膏對(duì)哮喘豚鼠肺組織作用的病理學(xué)研究J.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，19(6):473.6 王 曉，程傳格，劉建華.泡桐花精油化學(xué)成分分析J.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2005，25