血清濃度對脂肪成體干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的影響△

1、血清濃度對脂肪成體干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的影響        【摘要】     目的比較不同濃度的血清，在轉(zhuǎn)化生長因子1（TGF1）存在的條件下，對脂肪成體干細(xì)胞（adiposederived adult stem cells，ADASCs）向軟骨細(xì)胞分化的影響，探討較為合適的血清濃度。方法取成年新西蘭兔頸部脂肪組織，剪碎后通過型膠原酶消化，得到脂肪成體干細(xì)胞；穩(wěn)定傳代后，分別用含1FBS和10FBS的軟骨誘導(dǎo)液干預(yù)ADASCs 2周，采用MTT檢測方法對細(xì)胞增殖活性

2、進(jìn)行比較，應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色及型膠原免疫組化染色進(jìn)行軟骨細(xì)胞鑒定，利用Leica病理圖像軟件分析兩組間型膠原免疫組化染色后的灰度，比較兩組細(xì)胞分化的效果。結(jié)果MTT檢測顯示10FBS組細(xì)胞增殖活性高于1FBS組（P0.05），兩組細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色及型膠原免疫組化染色均為陽性，并以10FBS組更為顯著；灰度分析提示10FBS組型膠原表達(dá)量高于1FBS組（P0.05）。結(jié)論體外研究表明，含10FBS的軟骨誘導(dǎo)液更有利于脂肪成體干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向增殖和分化，這將為作者采用這種新型的干細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損做好前期的準(zhǔn)備。     【關(guān)鍵詞】  脂肪成體干

3、細(xì)胞； 血清濃度； 軟骨細(xì)胞    關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復(fù)和重建是骨科面臨的難題之一，迄今尚未得到很好的解決。傳統(tǒng)的治療方法如軟骨下鉆孔、磨削、微骨折等均存在一定的缺陷，但軟骨組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一難題帶來了新的契機(jī)。組織工程中，種子細(xì)胞的來源是其首要和基本因素。常用的種子細(xì)胞是未分化的前體細(xì)胞或稱為干細(xì)胞。最近，一種新的干細(xì)胞脂肪成體干細(xì)胞（adiposederived adult stem cells，ADASCs）已被人們從脂肪組織中提取出來。研究證明，脂肪成體干細(xì)胞具有體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、衰老較緩慢及多向分化的潛能16。目前對于脂肪成體干細(xì)胞向成

4、骨細(xì)胞分化的研究較多，但是向軟骨細(xì)胞分化的研究則相對較少。其原因在于脂肪成體干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化中存在許多不確定的因素，包括TGF1、血清、胰島素等的濃度以及誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法等。為此，作者在前期研究即TGF1為10 ngml的基礎(chǔ)上7，探討血清濃度對脂肪成體干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞增殖分化的影響，從而為這種新型干細(xì)胞更好修復(fù)軟骨缺損的深入一步研究提供實驗依據(jù)和參考。    1  材料與方法    1.1  材料    4個月齡新西蘭大白兔（第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供），重組人轉(zhuǎn)化生長因子1（P

5、eproTech），胰島素（Sigma），高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco），標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（杭州四季青），型膠原酶（Sigma），胰蛋白酶（Sigma），MTT試劑（Sigma），型膠原抗體（武漢博士德公司），24孔及96孔培養(yǎng)板（Costar），Leica病理圖像分析系統(tǒng)（德國）。    1.2  方法    1.2.1  脂肪成體干細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)7    取4個月齡新西蘭白兔，體重約2.5 kg，雌雄不限，速眠新0.5 ml麻醉后，無菌條件下切取頸部脂肪組織，清除肉眼可見的小血

6、管、包膜及結(jié)締組織，PBS清洗3次以去除紅細(xì)胞，剪碎后在含10FBS的DMEM中1 000 rmin離心5 min，棄去上清液，加入2倍體積0.2%型膠原酶，37 消化60 min后，加入等體積含10FBS的DMEM中和，200目篩網(wǎng)過濾，1 000 rmin離心10 min，去上清后，加入含10FBS的DMEM懸浮細(xì)胞，接種于25 cm2底面積培養(yǎng)瓶中，然后置于培養(yǎng)箱中，37 、5CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。3 d后首次換液，棄除未貼壁的細(xì)胞，以后每23 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長至融合時傳代，用2.5 gL的胰蛋白酶1 mmol/L EDTA于37 消化細(xì)胞12 min后，1 000 rmin

7、離心10 min，細(xì)胞稀釋3倍轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，23 d換液1次，傳至第3代。    1.2.2  脂肪成體干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化    取生長旺盛的第3代細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以5×103ml細(xì)胞密度接種于96孔板內(nèi)，每孔體積200 l；以3×104ml細(xì)胞密度接種于預(yù)先放置蓋玻片的24孔板內(nèi)，每孔體積1 ml，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，更換無血清培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后吸去無血清培養(yǎng)液，分別加入含兩種濃度血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)：（1）1血清組：含F(xiàn)BS 10 mlL、TGF1 10 n

8、gml、胰島素6.25 gml、維生素C 50 gml、青霉素100 Uml、鏈霉素100 Uml;（2）10血清組：含F(xiàn)BS 100 mlL、TGF1 10 ngml、胰島素 6.25 gml、維生素C 50 mgml、青霉素100 Uml、鏈霉素100 Uml。每3 d換液1次，均誘導(dǎo)2周。    1.2.3  MTT檢測細(xì)胞增殖活性    取96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每組3孔，分別于誘導(dǎo)后第3、7、14 d，每孔加入MTT溶液（5 mgml）20 l，在37 ，5 CO2孵箱繼續(xù)孵育4 h，小心棄去孔內(nèi)上清，加入DMSO 15

9、0 l，振蕩10 min，選擇492 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值（OD）。    1.2.4  甲苯胺藍(lán)染色及型膠原免疫組化染色    取24孔板內(nèi)的細(xì)胞爬片，于誘導(dǎo)后第14 d，行甲苯胺藍(lán)染色，并按型膠原免疫組化染色試劑盒說明進(jìn)行型膠原免疫組化染色。用Leica病理成像系統(tǒng)錄入型膠原免疫組化染色后的細(xì)胞圖像，進(jìn)行灰度值分析。    1.2.5  統(tǒng)計學(xué)處理    采用SPSS 13.0軟件行兩樣本t檢驗，分析比較兩組光吸收值的差異及型

10、膠原免疫組化染色的灰度值差異。    2  結(jié)果    2.1  脂肪成體干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察    原代培養(yǎng)的細(xì)胞于24 h內(nèi)貼壁，貼壁細(xì)胞胞漿突起，初期為短梭形或小多角形，單核，細(xì)胞體積較小，呈集落或分散生長，以后細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L梭形或多角形，呈類成纖維細(xì)胞樣；貼壁后的細(xì)胞增殖速度較快，多個集落互相連接并逐漸融合，7 d左右可長滿瓶底。傳代后細(xì)胞突起減少，多呈長梭形或三角形，漩渦狀生長，45 d可長滿（圖1）。    2.2  細(xì)胞增殖活性

11、0;   MTT比色法顯示在誘導(dǎo)后第3、7、14 d，10%FBS組OD值均顯著高于1% FBS組（P0.05），表明10% FBS組的細(xì)胞具有較好的增殖活性（圖2）。    2.3  甲苯胺藍(lán)染色    兩組細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色均呈陽性，10% FBS組的陽性染色程度較高（圖3）。    2.4  型膠原免疫組化染色    型膠原免疫組化染色見兩組細(xì)胞外基質(zhì)的型膠原表達(dá)均呈棕黃色陽性（圖4）。    2.5&

12、#160; 型膠原灰度值分析結(jié)果    Leica病理成像系統(tǒng)分析兩組細(xì)胞型膠原免疫組化染色后的灰度值結(jié)果見表1所示。采用SPSS 13.0軟件行兩樣本t檢驗，提示兩組間有顯著性差異（t=-13.306,P0.05）。表1  2組細(xì)胞型膠原灰度值分析結(jié)果（略）3  討論    組織工程軟骨構(gòu)建的首要條件是能獲得足夠數(shù)量的種子細(xì)胞，理想的種子細(xì)胞應(yīng)具有易擴(kuò)增、無免疫排斥及向所替代組織分化的潛能。由于成熟的軟骨細(xì)胞來源有限，體外增殖能力弱，且表型穩(wěn)定性差，難以滿足組織構(gòu)建的需要。因此，干細(xì)胞成為組織工程研究的熱點(diǎn)。干細(xì)

13、胞按照來源分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，兩者均有強(qiáng)大的自我更新能力及多向分化潛能，但胚胎干細(xì)胞由于涉及倫理道德問題使其應(yīng)用受到限制。因此，成體干細(xì)胞是目前組織工程中最重要的種子細(xì)胞來源。長期以來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）一直是組織工程研究中首選的種子細(xì)胞。然而，BMSCs在應(yīng)用過程中也發(fā)現(xiàn)一些問題8，學(xué)者們?yōu)榱烁玫难芯糠N子細(xì)胞，在多方面進(jìn)行了更廣泛的探索。    新近發(fā)現(xiàn)的脂肪成體干細(xì)胞（ADASCs）是一種來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，目前的研究已證實其具有與BMSCs類似的多向分化潛能。與BMSCs相比

14、，ADASCs組織來源數(shù)量更為充足，少量的脂肪組織便可獲取大量的成體干細(xì)胞，并不會因為年齡的增加而導(dǎo)致脂肪組織中干細(xì)胞數(shù)目的減少9，且其培養(yǎng)條件更為簡單，分化表型可長期維持，衰老較為緩慢。同時，抽吸脂肪對患者的損傷較小，與抽取骨髓相比，患者更易接受。因此，ADASCs是一種很有應(yīng)用前景的組織工程種子細(xì)胞。    干細(xì)胞向特定細(xì)胞分化的過程中，要經(jīng)歷增殖和分化兩個階段。一般認(rèn)為，這兩個階段是一個動態(tài)平衡的過程。細(xì)胞在分化的過程中，其增殖的速度將逐漸減慢，因此良好的增殖將有利于更多的干細(xì)胞向所需要的細(xì)胞分化。TGF1具有促進(jìn)原始的間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的作用10，它

15、對細(xì)胞的增殖作用較小。作為細(xì)胞培養(yǎng)中常用的添加成分，血清的重要性是不言而喻的。研究已經(jīng)證明，血清濃度不僅可以影響細(xì)胞的分化11，而且對細(xì)胞的增殖也具有重要的意義。由于血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚，其中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同時也存在細(xì)胞生長抑制因子，故而合適的血清濃度對于體外培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和分化是非常重要的。因此，本實驗對比了在TGF1為10 ngml的情況下，血清濃度對脂肪成體干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的影響。通過作者的實驗研究可以看出，MTT檢測結(jié)果顯示10血清較1血清更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，甲苯胺藍(lán)染色及型膠原免疫組化染色灰度分析則表明10血清具有更好的促進(jìn)ADASCs向軟骨細(xì)胞分化的作用。

16、因此，作者認(rèn)為含10濃度胎牛血清的軟骨誘導(dǎo)液對于ADASCs的增殖和分化效果更好。由于不同來源、不同批次的血清質(zhì)量變化較大，可能會造成實驗結(jié)果的數(shù)值不盡相同，本研究的目的是為了說明血清濃度在誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化兩方面的影響，在此基礎(chǔ)上，作者將進(jìn)一步探討其他可能影響ADASCs向軟骨細(xì)胞增殖、分化的因素，提供使用這種新型干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的較成熟的經(jīng)驗。    （本文附圖見加頁4）（略）       【參考文獻(xiàn)】  1 Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.Human

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