靈芝深層發(fā)酵生產(chǎn)四環(huán)三萜酸的研究-

1、靈芝深層發(fā)酵生產(chǎn)四環(huán)三萜酸的研究李平作1,徐柔2,夏結紅2,章克昌2(1.中科院上海生物工程研究中心,上海200233;2.無錫輕工大學生物工程學院,無錫214036摘要從靈芝深層發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到三種四環(huán)三萜酸,命名為靈芝酸M1,M2,M3。在25L 發(fā)酵罐上研究了發(fā)酵條件對靈芝酸產(chǎn)量的影響,以及靈芝酸的代謝形成特征。結果表明最適發(fā)酵條件是:溫度30;通風量10.75v/v/m ;攪拌轉速180r/min ;發(fā)酵時間80h ,此時靈芝酸的最高產(chǎn)量是0.36g/L 發(fā)酵液。抑菌實驗表明上述靈芝酸能夠抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、腸炎桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長。關鍵詞:靈芝;深層發(fā)酵;靈

2、芝酸;抑菌作者簡介:李平作(1967,男,博士。靈芝中四環(huán)三萜類化合物是近年來發(fā)現(xiàn)的靈芝中另外一類具有明顯藥理活性的化合物,具有護肝和排毒1、降血壓2、降膽固醇3等作用。靈芝中四環(huán)三萜類物質首先由Kubota T.4等從靈芝(G.l uci dum 的子實體中得到;此后Nishitoba 5和Hirotani 6等作了大量的研究報道;國內這方面的研究起步較晚,陳若蕓7在他們的綜述中論及靈芝中四環(huán)三萜酸的研究進展;王芳生等8報道了赤芝子實體中四環(huán)三萜酸成分;利用深層發(fā)酵生產(chǎn)四環(huán)三萜酸可以縮短生產(chǎn)周期,提高產(chǎn)量,而國內無論是其發(fā)酵技術還是其生物活性檢測都尚未報道。本實驗室對靈芝發(fā)酵產(chǎn)物中的三萜酸(

3、以下簡稱靈芝酸進行了較深入地研究9,并檢測了其抑菌活性,從而為產(chǎn)品開發(fā)提供了依據(jù)。1材料與方法1.1材料實驗室篩選保存。2.1深層發(fā)酵參考有關文獻10,11以甲苯乙酸乙酯乙酸(1240.5為展開劑,以硫酸甲醇(11為顯色劑,通過硅膠薄層層析法定性分析發(fā)酵產(chǎn)物中的靈芝酸。2結果與討論2.1靈芝深層發(fā)酵液中四環(huán)三萜酸定性分析51第30卷第1期2000年3月工業(yè)微生物Industrial MicrobiologyMar.2000利用薄層層析法進行有效成分的定性分析至今仍是一種常規(guī)的檢測方法。以甲苯:乙酸乙酯:乙酸(1240.5為展開劑,以硫酸:甲醇(11為顯色劑,硅膠薄層層析法定性分析發(fā)酵產(chǎn)物中的靈

4、芝酸。圖1是靈芝酸的薄層層析圖譜 。圖1靈芝酸的薄層層析圖譜由圖中可以看出,發(fā)酵產(chǎn)物中有三個明顯斑點,它們的R f 值在0.150.70之間。以硫酸:甲醇為顯色劑時,還可以判別三萜酸基本結構的飽和與不飽和情況13。在實驗中我們觀察到M1(R f =0.56和M2(R f =0.49先顯亮紅色,然后變?yōu)樽仙?M3(R f =0. 17則由橙色變?yōu)樽仙?這表明三種靈芝中四環(huán)三萜酸都具有不飽和特性,否則呈黃色并逐漸褪色。紫外光譜、紅外光譜、核磁共振及質譜分析也進一步證實上述三種物質屬四環(huán)三萜酸9。2.2發(fā)酵過程中靈芝酸的形成代謝特性由圖2中可以看出,靈芝酸的形成與菌體的生長之間存在明顯區(qū)別,即在菌體

5、生長達到平衡期后,靈芝酸才大量形成。這與其它微生物次級代謝產(chǎn)物,比如青霉素的形成相似14。靈芝酸的最高峰在80h 左右,靈芝酸的含量是0.36g/L 發(fā)酵液,其后靈芝酸濃度降。因此,當以靈芝酸為目標產(chǎn)物時,必須掌握好發(fā)酵終點,我們認為控制在第80h 放罐是適宜的。2.3通風量和攪拌轉速對靈芝四環(huán)三萜酸產(chǎn)量的影響在25L 機械攪拌發(fā)酵罐上,通過改變通氣量和攪拌轉速來確定靈芝酸較適宜的發(fā)酵條件,結果見表1 。圖2靈芝酸形成曲線表125L 發(fā)酵罐實驗結果實驗號123通風量(v/v/m 0.240.360.223經(jīng)硅膠柱層析純化后的數(shù)據(jù)。由實驗結果可以看出,通風量和攪拌速度過大和過小都不利于靈芝酸的形

6、成。在攪拌速度和通風量較小的條件下,發(fā)酵罐內的傳質情況較差,導致菌體生長環(huán)境不良,不利于靈芝酸的形成;攪拌速度過大,導致菌絲體的機械破壞及液泛,影響靈芝酸的形成。因此我們選擇發(fā)酵通風量為10.75v/v/m ,攪拌轉速180r/min 。2.3靈芝酸的抑菌活性通過濾紙透明圈法檢測了靈芝酸對不同微生物的抑菌活性。結果見表2及圖3。由表2中可以看出,靈芝酸對不同微生物的抑制能力是不同的。對大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌和腸炎桿菌的抑制效果較好,而對枯草芽孢桿菌效果較差;三種靈芝酸中以M1的抑菌能力較強。為了更直觀地證明其抑菌活性,我們挑選了部分明顯的透明圈進行攝影,見圖3。3結論(1從靈芝深層發(fā)酵液中分離得到

7、三種靈芝酸,M1(R f =0.56,M2(R f =0.49,M3(R f =0.17。61第1期工業(yè)微生物第30卷表2靈芝酸的抑菌活性腸炎桿菌產(chǎn)氣桿菌金黃色葡萄球菌大腸桿菌枯草桿菌M1+M2+-M3+ -圖3靈芝酸的抑菌活性(2通風量和攪拌轉速對靈芝酸的產(chǎn)量影響較大,最適通風量和攪拌轉速分別是10.75v/v/m 和180r/min ;發(fā)酵時間80h ;靈芝酸的最高產(chǎn)量達0.36g/L 。(3靈芝酸能抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、腸炎桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長,為產(chǎn)品開發(fā)提供了依據(jù)。致謝:本文承蒙上海市工業(yè)微生物研究所胡學智教授審閱,在此表示衷心感謝!參考文獻197:47Chem.

8、,1965,211:190196Production of tetracyclic triterpenoid acids by submergedfermentation of Ganoderma lucidumL I Ping 2zou ,XU Rou ,XIA Jie 2hong ,ZHAN G K e 2chang(School of Biotechnology ,Wuxi University of Light Industry ,Wuxi 214036Abstract Three tetracyclic triterpenoid acids ,named ganoderic acid

9、s M1,M2,M3,were isolated from the fermentaion products by submerged fermentation of G.l ucidum.The fermentation conditions and the metabolic properties of ganoderic acids in 25L fermentor were studied.The results showed that the maxi 2mum yield of ganoderic acids was 0.36g/L which was obtained under the optimum conditions :tempera 2ture ,30;agitation rate ,180r/min ;air velocity ,10.75(v/v/m ;fermentation period ,80hours.The antimicrobial test showed that ganoderic acids could inhibit the growth of Eschrichia coli ,Aerobacteraerogenus ,S al monella enteritidis ,Stap