拉莫三嗪改善阿爾茨海默病APPswePS1dE9雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠認知功能的實驗研究

1、拉莫三嗪改善阿爾茨海默病APPswe/PS1dE雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠認知功能的實驗研究阿爾茨海默病(Alzheimersdisease,AD)是以p-淀粉樣蛋白(B-amyloid,AB)沉積與tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結為特征的神經(jīng)退行性疾病。不斷增多的Ap和神經(jīng)纖維纏結進一步引起慢性神經(jīng)炎癥反應,導致突觸、神經(jīng)元缺失,以及進行性的認知功能障礙。目前認為，靶向針對增多的Ap和tau蛋白過度磷酸化是治療AD的主要策略。文獻報道AD患者表現(xiàn)出更高的癲癇發(fā)生率，并且在大量的AD轉(zhuǎn)基因動物模型腦內(nèi)均發(fā)現(xiàn)存在神經(jīng)網(wǎng)絡異常興奮性的現(xiàn)象。這種神經(jīng)網(wǎng)絡活動異常興奮性以及海馬代償性產(chǎn)生的抑制性機制可能是

2、導致AD以及AD轉(zhuǎn)基因動物模型認知障礙的原因。因此，靶向針對性抑制腦內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡的異常興奮性，可能有效抑制AD的進行性學習與記憶障礙。Sanchez等人研究發(fā)現(xiàn),抗癲癇藥物左乙拉西坦通過抑制腦內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡異常興奮性顯著改善mAPPJ20AD基因小鼠認知能力的作用。這些研究成果為抗癲癇藥物在AD治療上的運用提供了一種新的策略。但并不是所有的抗癲癇藥物都顯示出這樣的療效。另一些抗癲癇藥物反而會加重AD腦內(nèi)異常的神經(jīng)網(wǎng)絡活動并且導致認知功能進行下降，如鈉離子通道抑制劑苯妥英鈉、卡馬西平、苯巴比妥、普瑞巴林以及苯二氮卓類抗癲癇藥物等。因此，本實驗擬研究抗癲癇藥物拉莫三嗪能否抑制AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)神經(jīng)超興奮

3、性,能否改善記憶功能的作用,并探討其可能的分子機制。拉莫三嗪(lamotrigine,LTG)是一種廣譜的抗癲癇藥物，用于12歲以上兒童及成人具有簡單部分性發(fā)作、復雜部分性發(fā)作、繼發(fā)性全身強直-陣攣性發(fā)作及原發(fā)性全身強直-陣攣性發(fā)作等癲癇的治療。拉莫三嗪尤其對老年女性癲癇患者顯示了獨特的顯著療效。此外，LTG還運用于治療雙向躁狂抑郁障礙、精神分裂癥以及偏頭痛、神經(jīng)痛等其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病。更引人注意的是,拉莫三嗪對成年癲癇患者有改善認知功能的作用。Tekin等人用LTG治療診斷為AD的11例病人中,發(fā)現(xiàn)能顯著改善患者認知能力與命名能力,并且還顯著改善患者抑郁情緒,顯示了良好的療效。但是,LTG能否

4、有效抑制AD腦內(nèi)異常的神經(jīng)網(wǎng)絡活動，是否能改善AD患者的認知功能，還不得而知。本研究運用抗癲癇藥物LTG治療ADAPP/PS1(hAPPswe/PS1dE9)基因模型小鼠,觀察對其病理與行為的影響及探討可能的分子機制。本研究發(fā)現(xiàn)，LTG長期處理能有效改善APP/PS仞、鼠突觸可塑性、抑制腦內(nèi)Ap的沉積和神經(jīng)元的缺失，改善APP/PS1小鼠的學習與記憶功能。LTG突觸可塑性的改善作用可能與上調(diào)APP/PS1腦內(nèi)腦原性神經(jīng)生長因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)與神經(jīng)生長因子(Nervegrowthfactors,NGF)的水平,還可能與調(diào)控環(huán)酸腺甘反應

5、單元結合蛋白(cAMP-responsiveelementbindingprotein,CREB)磷酸化水平有關。止匕外,LTG可能通過下調(diào)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠糖原合酶激酶3-B(Glycogensynthasekinase-3p,GSK-30)磷酸化水平，降低B-分泌酶(p-secretase,BACE1的水平,減少AB的神經(jīng)病理損害，改善記憶功能。第一章拉莫三嗪有效改善阿爾茨海默病APPswe/PS1dE9?；蚰Ｐ托∈蟮恼J知功能目的：研究廣譜抗癲癇藥物LTG對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學習與記憶的影響方法：將野生動物和APPswe/PS1dE取轉(zhuǎn)基因小鼠分為四組，各組20只，分別是：

6、野生小鼠拉莫三嗪處理組(WT+LTG)野生小鼠安慰劑對照組(WT);APPswe/PS1dE或轉(zhuǎn)基因小鼠拉莫三嗪處理組(TG+LTG);APPswe/PS1dE吸轉(zhuǎn)基因小鼠拉莫三嗪安慰劑對照組(TG)。各組小鼠在3個月齡大小時候開始給以添加了拉莫三嗪和安慰劑的飼料飼養(yǎng),每天飼養(yǎng)兩次,處理5個月,四組小鼠在8個月齡時,應用水迷宮和新物體識別等行為學評估抗癲癇藥拉莫三嗪對APPswe/PS1dE或轉(zhuǎn)基因小鼠學習與記憶的影響。結果：水迷宮隱蔽平臺實驗中,重復測量方差分析統(tǒng)計結果顯示：各實驗組小鼠逃逸潛伏期的分組效應(F=18.343,P=0.000)、時間效應(F=14.461,P=0.000)與游

7、泳距離的分組效應(F=14.211,P=0.000)、時間效應(F=19.090,P=0.000)差異具有顯著性,說明分組因素和時間因素對各組動物空間學習記憶能力有影響。相比野生小鼠，對照組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠逃逸潛伏期、游泳距離明顯延長；而拉莫三嗪處理組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的逃逸潛伏期、游泳距離比對照組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠明顯減少；為了排除速度的影響,我們將每組小鼠的第一天逃逸時間標準化為1,以后每組每天的逃逸潛伏期與第一天的進行比較,觀察各組動物的學習趨勢,結果顯示,野生對照組和野生處理組小鼠均顯示了良好的學習趨勢,而轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M卻沒有一個不斷學習的趨勢,給以拉莫三嗪處理后,轉(zhuǎn)

8、基因小鼠隨著訓練時間也呈現(xiàn)了良好的學習趨勢。野生對照組與野生處理組間逃逸潛伏期、游泳距離與標準化潛伏期無顯著差異。水迷宮空間探索實驗中，拉莫三嗪處理組APP/PS1/J、鼠比對照組小鼠穿越平臺象限區(qū)域的次數(shù)明顯比對照組小鼠增多(F=3.919,P=0.021)。新物體識別實驗中,各組小鼠對放在礦場區(qū)角落處兩個相同的物體A沒有特別的偏愛,不影響各組動物下一步對新物體B的開采行為(F=0.314,P=0.815)。在開采實驗階段,轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠對新物體B的認知指數(shù)相比野生型小鼠更少,顯示出它們有記憶障礙(P=0.001)。而APP/PS1拉莫三嗪處理組模型小鼠較對照組有顯著增高的認知指數(shù)(P=0

9、.006),野生對照與野生拉莫三嗪處理組之間識別指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P=0.183),說明拉莫三嗪可以改善APP/PS1小鼠的記憶障礙，而不影響正常小鼠的行為認知功能(F=5.370,P=0.005)。結論：8個月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠有明顯的學習、記憶損害；抗癲癇藥物拉莫三嗪能有效改善PP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學習與記憶能力；LTG對正常小鼠的學習記憶能力無影響。第二章拉莫三嗪對APPswe/PS1dE9?；蛐∈笊窠?jīng)網(wǎng)絡活動及阿爾茨海默病相關病理的作用研究目的：研究拉莫三嗪長期治療對APPswe/PS1dE轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)網(wǎng)絡活動的調(diào)控作用及AD病理變化的影響。方法：將動物分為WT,W

10、T+LTG,TQTG+LTG5組，每組6只。在動物3個月齡大小時候分別給以拉莫三嗪和安慰劑治療2個月,在5月齡大小的時候監(jiān)測皮層、海馬腦電圖，評估APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)腦電活動，評估抗癲癇藥物LTG對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)腦電活動的影響。其余實驗在各組小鼠行為學結束后,灌注固定,取材,切片,進行病理學分析。用免疫組織化學法評估拉莫三嗪對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠皮層、海馬Ap沉積的影響，免疫熒光方法評估抗癲癇藥物拉莫三嗪對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)GFAP舊A-1、NPYNeuN表達的影響。結果：各組小鼠腦內(nèi)皮層、海馬腦電波節(jié)律差異具有顯著性(F=41.73,P=0.000、F=3

11、1.72,P=0.000)。相比WT組,TG組小鼠皮層、海馬內(nèi)均可見明顯異常高尖的癲癇樣腦電波(P<0.01),存在異常的神經(jīng)網(wǎng)絡活動；而TG+LTG&皮層、海馬高尖異常的腦電活動得到了明顯的抑制(P=0.005、P=0.008)，顯示APP/PS1小鼠腦內(nèi)異常的神經(jīng)網(wǎng)絡活動得到有效的抑制。WT組與WT+LTG1小鼠皮層、海馬未見明顯異常節(jié)律的腦電活動(P=0.973)。NPYfe疫熒光2果顯示，各組小鼠皮層、海馬NP3日性細胞表達差異具有顯著意義(F=3.157,P=0.036；F=3.297,P=0.031),TG組小鼠腦內(nèi)皮層、海馬NPY陽性細胞表達比WT小鼠顯著增

12、高(P=0.010、P=0.010),而TG+LTG&皮層、海馬NPYffl性細胞表達比TG組小鼠明顯降低(P=0.041、P=0.041)。TG組小鼠腦內(nèi)可見一定數(shù)量和體積大小的Ap沉積,TG+LTG組小鼠皮層、海馬Ap沉積的數(shù)量(t=1.154,P=0.042;t=0.158,P=0.019)和體積大小(t=-1.71,P=0.013；t=-0.565,P=0.01)相對TG組小鼠明顯減少；與Wffi相比,TG組小鼠皮層可見神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少(P=0.023),而TG+LTG&小鼠皮層神經(jīng)元的數(shù)量比TG組明顯改善(P=0.047),接近WT組小鼠的水平。各組海馬神經(jīng)元的數(shù)

13、量無顯著差異(F=1.047,P=0.385)；各組小鼠腦內(nèi)皮層、海馬星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞表達差異具有顯著性(F=23.379,P=0.000;F=22.968,P=0.000)(F=40.96,P=0.000;F=38.577,P=0.000)。相比WTfi,TG小鼠皮層、海馬GFAP+Iba+細胞所占的體積百分比顯著升高(P<0.01),而TG+LTG&小鼠皮層、海馬GFAP+(P=0.027P=0.018)、Iba+(P=0.011、P=0.022)細胞所占的體積百分比明顯降低；Wffi和WT+LTG&兩組之間GFAP+.IBA1+細胞所占體積百分比差異

14、無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。結論：APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)存在神經(jīng)網(wǎng)絡異常興奮性現(xiàn)象；抗癲癇藥物拉莫三嗪能抑APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡異常興奮性；LTG能顯著減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Ap的沉積；LTG能抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元的缺失；LTG能抑偉APP/PS1轉(zhuǎn)基因模型小鼠腦內(nèi)星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞的激活，減輕腦內(nèi)慢性炎癥反應。第三章拉莫三嗪長期處理對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠突觸可塑性的影響。目的：研究LTG長期處理是否具有改善APP/PS1鼠突觸可塑性的作用。方法：將動物分為WT,WT+LTG,TG,TG+LTG3組。在動物3個月齡大小時

15、候分別給以拉莫三嗪和安慰劑治療5個月,在8月齡大小的時候電生理檢測各組動物海馬LTP(Long-termpotentiation)的情況,評估抗癲癇藥物拉莫三嗪對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬LTP的影響；高爾基染色檢測各組動物腦內(nèi)樹突棘的表達，評估抗癲癇藥物拉莫三嗪對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)樹突棘突的影響；免疫熒光染色檢測各組動物海馬突觸素蛋白的表達,評估抗癲癇藥物拉莫三嗪對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬突觸素蛋白的影響。結果：為了評價拉莫三嗪對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的突觸可塑性的影響，我們用電生理分別記錄了4組(WT,WT+LTG,TG,TG+LTG)CA1區(qū)錐體細胞層的LTP的改變。在

16、前30分鐘的基本刺激條件下，具基礎fEPSP曲線保持穩(wěn)定。當給各組高頻強直刺激后,LTP誘發(fā)成功并持續(xù)記錄60分鐘。TG組小鼠fEPSP的幅度、初始面積比W1組小鼠顯著減少，顯示了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)LTP受損害；而TG+LTG&小鼠其fEPSP幅度、初始面積較TG組小鼠都明顯增加，說明拉莫三嗪有效改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠LTP(F=15.631,P=0.001;F=8.625,P=0.000);WT組與WT+LTG!小鼠fEPSP幅度、初始面積兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。通過高爾基染色方法對各組動物皮層、海馬樹突棘的觀察,并進行統(tǒng)計,結果顯示,各組

17、動物皮層、海馬樹突棘差異有顯著意義(F=2.707,P=0.054;F=2.906,P=0.043)TG組小鼠皮層、海馬內(nèi)樹突棘的密度比W組小鼠明顯減少，大量的樹突棘受到損害,突觸可塑性受限,LTP損害(P=0.037、P=0.009)；然而,拉莫三嗪長期處理后的TG+LTGfi小鼠皮層、海馬的樹突棘密度比TG組小鼠明顯改善，單位長度樹突棘數(shù)量增多,長度變長,頭端變粗,突觸可塑性得到一定的恢復(P=0.039、P=0.031);拉莫三嗪對正常小鼠的突觸可塑性無影響,表現(xiàn)為WT組與WT+LTG1小鼠樹突棘密度差異無統(tǒng)計學意義(P=0.649、P=0.603)。此外,突觸素蛋白SYN免疫熒光染色結

18、果與高爾基染色結果相一致，各組動物海馬SY映光密度差異有統(tǒng)計學意義(F=7.282,P=0.000),表現(xiàn)為TG+LTG&小鼠海馬突觸素的密度較TG組顯著改善(P=0.01)。說明LTG具有顯著改善突觸可塑性的作用。結論：拉莫三嗪長期處理能恢復APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)損害了的LTP;拉莫三嗪長期治療能阻止APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)樹突棘的丟失；拉莫三嗪長期處理能阻止APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)突觸素蛋白的丟失；拉莫三嗪具有改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠突觸可塑性的作用。第四章拉莫三嗪對APPswe/PS1dE9?；蛐∈笊窠?jīng)保護作用及其機制的實驗研究ChapterIV.Theex

19、perimentalresearchoftheneuroprotectiveroleoflamotrigineinAPPswe/PS1dE9mice目的：研究拉莫三嗪對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)保護作用及可能的分子機制。方法：將動物分為WT,WT+LTG,TG,TG+LTG3組。在動物3個月齡大小時候,分別給以含有拉莫三嗪和安慰劑的飼料飼養(yǎng)5個月。日isa檢測WT,WT+LTGTG,TG+LTG3組動物皮層、海馬BDNFNGFffiNT-3等營養(yǎng)因子的水平,Westernblotting檢測WT,WT+LTG,TG,TG+LTG3組動物皮層、海馬CREBp-CREBp-GSK3PBACE1APPAPP-CTFs®表達。結果：APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠皮層BDN冰平與海馬NGFK平相比Wffi顯著降低，而LTGtg升高APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠皮層BDNF勺水平(F=4.44,P=0.041)和海馬NGF勺水平(F=4.505,P=0.039),海馬BDNF勺水平(F=1.6