單克隆抗體制備試驗(yàn)過程

1、單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程免疫動(dòng)物免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏 B 淋巴細(xì)胞的過程。 一般選用 6-8 周齡雌性 Balb/c 小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注 射。 抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng) B 淋巴細(xì) 胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏 B 淋巴細(xì)胞。說明：FCA弗氏完全佐劑；FIA，弗氏不完全佐劑； Quickantibody ，北京康碧泉公司研制的佐劑。 上表中第四種免疫方法產(chǎn)生的抗體大部份都為 IgM，存在親和力弱等缺點(diǎn)，慎用。PS 1、一般皮下注射每個(gè)注射點(diǎn)注射 30-50ul左右混有佐劑的抗原，每只 小鼠注射 6-8 個(gè)點(diǎn)為宜。2

2、 、腹腔注射時(shí)，如果抗原混有弗氏佐劑，建議注射在左側(cè)腹腔，如 果采用右側(cè)腹腔注射， 則在免疫過程中， 很容易導(dǎo)致小鼠脾臟與腹膜粘連的 情況，造成后期取出脾臟麻煩。3 、沖擊免疫完成后，應(yīng)在 96 小時(shí)內(nèi)完成細(xì)胞融合，否則相應(yīng)的 B 細(xì) 胞數(shù)量會(huì)下降到未沖擊前的水平 。二、細(xì)胞融合 （ Cell fusion ）【材料和試劑】（ 1 ）骨髓瘤細(xì)胞懸液 選好骨髓瘤細(xì)胞株，取體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長期細(xì) 胞或體內(nèi)生長的腫瘤分離骨髓瘤細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。（2）免疫小鼠脾細(xì)胞懸液 取 3 天前加強(qiáng)免疫的小鼠，眼眶放血， ?分 離血清凍存?zhèn)溆?。拉頸處死小鼠，浸泡于 75%酒精中35min。無菌操作取 出脾臟，置入

3、盛有 5ml 不完全培養(yǎng)液的平皿中洗滌，剪去周圍的結(jié)締組織， 將脾臟移入另一盛有 5ml 不完全培養(yǎng)液的平皿中的鋼網(wǎng)上，先用剪刀剪成 35 個(gè)小塊，然后用注射器內(nèi)芯研磨。 將脾臟細(xì)胞懸液移至 50ml 離心管中， 加不完全培養(yǎng)液50ml, 1000r/min離心5min,棄上清，再以同法洗滌離心一 次。然后將沉淀細(xì)胞重新懸浮于 10ml 不完全培養(yǎng)液中，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，一般 一只小鼠可得0.52X 108個(gè)脾細(xì)胞。（3）飼養(yǎng)細(xì)胞 將小鼠致死、體表消毒和固定后,用消毒剪鑷從后腹 掀起腹部皮膚,暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射 10ml 不完全培養(yǎng)基至腹腔,注意避免穿入腸管。右手固定注射

4、器,使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培養(yǎng)液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5ml HAT培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮， 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加 HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為2X 105/ml，備用。（4）主要試劑的配制細(xì)胞培養(yǎng)基雜交瘤技術(shù)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基主要有 RPMI-1640或DMEMDulberco Modified Eagles Medium ）兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配好后過濾除菌（0.22um）,分裝，4°C保 存。不完全RPMI-1640培養(yǎng)基:RPMI-1640培養(yǎng)基原液96ml100X L.G.溶液1ml雙抗溶液1ml7.5%N

5、aHCO溶液1-2mlHEPES§液1ml不完全DMEI培養(yǎng)基:DMEM13.37g超純水或四蒸水980mlNaHCO33.7g雙抗溶液10ml100X L.G.溶液10ml用1N HCl調(diào)試PH至7.2-7.4，過濾除菌，分裝4C保存完全RPMI-1640或DMEI培養(yǎng)基:不完全RPMI-1640或DMEI培養(yǎng)基80ml小牛血清15-20mlHT或HAT培養(yǎng)基:LJTd差甘HI 培養(yǎng)基HAT培養(yǎng)基完全RPMI-1640或DME培養(yǎng)基99ml98mlHT貯存液1ml1mlA貯存液1ml 氨基喋呤（A）貯存液（100X，4X 10-5mol/L ）稱取1.76mg氨基喋呤（Ami no

6、pterin MW 440.4 ），溶于90ml超純水或四蒸水中，滴 加1mol/L NaOHD.5ml中和，再補(bǔ)加超純水或四蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/ 瓶），-20 C保存。 次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷 （HT）貯存液（100X，H: 10-2mol/L, T: 1.6 X 10-3mol/L ） 稱取136.1mg次黃嘌呤（Hypoxanthine，MW 136.1）和 38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine , MW 2422,加超純水或四蒸水至100ml，置45-50 C水浴中使完全溶解， 過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20 C凍存。用前可置37C加溫助溶。

7、 L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100X，0.2mol/L ）稱取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine , MW46.15）,用100ml不完全培養(yǎng)液或超純 水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20 C凍存。 青、鏈霉素（雙抗）溶液（100X）取青霉素G （鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g,溶于100ml滅菌超純水或四 蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20 C凍存。 7.5% NaHCO溶液稱取分析純NaHCO7.5g，溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/ 瓶），蓋緊瓶塞，4C保存。 HEPESS液（1mol/L ）

8、稱取 23.83g HEPES （ N-2-Hydroxyethylpiperazine-N ， -2-ethanesulfonic acid ， N-2-羥乙基哌嗪-N , -2-乙基磺酸，MW 238.3溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除 菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4C保存。 8-氮鳥嘌呤貯存液（100X）稱取 200mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine， MW 152.1），加入 4mol/L NaOH 1ml，待其 溶解后，加入超純水或四蒸水 99ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20 C凍存。使用時(shí)按1%農(nóng) 度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為 20ug/ml ）。 50% PE

9、G稱取PEG 1000或4000 20-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80 C水浴融化，0.6ml分裝 于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20 C存放備用。臨用前加熱融化，加等 量不完全培養(yǎng)基，用少許 7.5% NaHCO調(diào)PH至8.0，或購買Sigma或Gibco公司現(xiàn)成產(chǎn) 品。（5）24 孔及 96 孔培養(yǎng)板等細(xì)胞培養(yǎng)所用材料和試劑。 【操作步驟】（1） 將準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按1: 51: 10比例混合，？ 加入 2050ml RPMI-1640 液。（2）1000r/min x 610min離心棄上清，將上清盡量吸凈。（ 3）用手指輕輕擊打離心管底部，使沉淀細(xì)胞分

10、散，將離心管置37C水浴中。（4）吸取1ml 37C預(yù)溫的50% PEG緩慢滴入離心管內(nèi)，45秒左右加完， 邊加邊輕輕攪拌，37 C靜置15min。（5）在5min內(nèi)滴加不完全完全培養(yǎng)液（37 C預(yù)溫）20ml，第一分鐘內(nèi)滴 加1ml，第2分鐘2ml，第3分鐘5ml，第4和第5分鐘各6ml，同時(shí)應(yīng)邊加 邊輕輕地轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，應(yīng)沿管壁滴加，不應(yīng)直接滴加在沉淀細(xì)胞上，以防將 剛?cè)诤系募?xì)胞沖開。然后加1640液至50ml使PEG作用終止。（6）800r/min x 510min 離心，棄上清。（7）?將沉淀細(xì)胞輕輕懸浮于所需容積的 HAT培養(yǎng)液中，接種24孔板 （每孔 1.0-1.5ml ）或 96

11、孔培養(yǎng)板（每孔 0.10-0.15ml ）。（8）接種完畢后，將培養(yǎng)板放入 37C 5%CO2 溫箱中培養(yǎng)。 PS:1、凍存的骨髓瘤細(xì)胞在復(fù)蘇后要2周時(shí)間才能處于適合于融合的狀態(tài)， 培養(yǎng)目標(biāo)是使處于對(duì)數(shù)生長的時(shí)間盡可能長。2 、飼養(yǎng)層細(xì)胞應(yīng)在使的前一天制備好， 這樣才能分泌足夠的細(xì)胞因子。三、選擇性培養(yǎng)原理：在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤- 磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成 DNA而死亡。未融合的淋巴細(xì)胞 雖具有次黃嘌呤 -鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶， 但其本身不能在體外長期存活也 逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸 核糖轉(zhuǎn)移酶，并

12、具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。（1）接種24孔板或96孔板5天后，用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。（2）7-10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全 培養(yǎng)基）。PS:1 、經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況， 待其長至孔底面積 1/10 以上時(shí)吸出 上清供抗體檢測(cè)。四、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化 雜交瘤細(xì)胞在融合后 2 周左右即可篩選， 選用抗體檢測(cè)方法的原則是快 速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力，通常根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn) 室的條件而定，一般制備單抗的目的決定了篩選克隆所用的方法。由于融合 后，細(xì)胞上清份數(shù)多，但每份體積有限，因此 E

13、LISA是最適合用于初步篩選 的方法。經(jīng)過ELISA篩選出的陽性克隆即可進(jìn)行克隆化，因?yàn)槿绻贿M(jìn)行克 隆化，當(dāng)陽性孔有非抗體分泌型的雜交瘤時(shí)，非抗體分泌型的雜交瘤由于生 長速度更快，將會(huì)占主導(dǎo)生長，最終很難分離出目標(biāo)雜交瘤以至丟失。另外 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn) 生抗體的能力。 通常在得到針對(duì)預(yù)定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進(jìn)行 2-3 次克 隆化，有時(shí)還需進(jìn)行多次?？寺』姆椒ê芏啵缬邢尴♂尫?、軟瓊脂法、 單細(xì)胞顯微操作法、單克隆細(xì)胞集團(tuán)顯微操作法和熒光激活細(xì)胞分類儀（FACS分離法。（1）包被 將抗原以pH9.6的NaC03-NaHC（包被，每塊酶標(biāo)板

14、以5-20 ug 抗原為宜（如果抗原為多肽或小分子物質(zhì)，則需要加大包被量） 。每孔的 包被體積為50-100 ul。37 C包被2 h或4 C包被過夜。（2）封閉 倒掉抗原，拍干酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，以 0.5-1% BSA（用PBST 溶解）或5%脫脂牛奶（PBST溶解）或1%明膠（PBST溶解）于37 C封閉2 h或4 C封閉過夜，也可以使用10%、牛血清或其它無關(guān)物種血清封閉。 封閉完后可立即使用，也可以洗滌一次置于 4 C密封保存以備后面使用。（ 3）一抗 封閉完后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，加入待檢測(cè)細(xì)胞上清，每孔100 ul為宜。在每塊板子上做好記號(hào)。37 C孵育1 h。（4） 二抗 孵育完一

15、抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，以PBST洗滌3次， 每次5min。根據(jù)二抗說明稀釋好二抗，每孔加入 100 ul.37 C孵育1 h。（5）顯色 孵育完二抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，加入顯色劑。待顏色最深時(shí)用終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀讀出各孔0D值，選擇出陽性孔。（ 1 ） 有限稀釋法 從有限稀釋的原理以及影響因素可以知道， 其克隆化結(jié)果應(yīng)該是一個(gè)修 正的泊松分布：式中入在有限稀釋里的意義是稀釋時(shí)設(shè)計(jì)的每孔細(xì)胞的平均數(shù),k則代表可能出現(xiàn)的細(xì)胞個(gè)數(shù)。材料：a、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等；b、HT培養(yǎng)基；c、活力強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞； d、小鼠腹腔細(xì)胞。方法：a、制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）。b 、制備待克隆的雜交瘤細(xì)

16、胞懸液，用含 20%血清的HT培養(yǎng)基稀 釋至每毫升含 2.5、 15和 50個(gè)細(xì)胞 3 中不同的稀釋度。c、按每毫升加入5X 104-1 x 105細(xì)胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入腹腔巨噬細(xì)胞。d 、每種雜交瘤細(xì)胞分裝 96 孔板一塊，每個(gè)稀釋度 32 孔，每孔 量為0.2ml，每孔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為 0.5、3和10。e 、37C、7.5% CO2濕潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可 檢測(cè)抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個(gè)克隆生長的孔，取上清作抗 體檢測(cè)。f 、取抗體檢測(cè)陽性孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存。g、本法中（b）、（ c）、（d）也可簡化為將計(jì)數(shù)后的雜交瘤細(xì)胞準(zhǔn)確地

17、進(jìn)行系列稀釋，直至每毫升含 10個(gè)細(xì)胞，按每孔接種 0.1ml 細(xì)胞懸液， 即每孔含 1 個(gè)細(xì)胞。（ 2）軟瓊脂法材料：a、HT培養(yǎng)基（雙倍濃度）。b、用0.15mol/L NaCl配制的2.0% 瓊脂糖：稱取2.0g細(xì)胞培養(yǎng)用瓊脂糖，懸浮于100ml 0.15mol/L NaCl, 121C 高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后4C保存。c、小鼠腹腔細(xì)胞。d、滅菌平皿。e、45C水浴。f、活力很好的雜交瘤細(xì)胞。 方法：a、在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）單層。b、 臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混 勻，配成1癥脂糖培養(yǎng)液，45C水浴中溫育。c、吸去平

18、皿上層培養(yǎng)液，加入1癥脂糖培養(yǎng)液3ml，室溫10分鐘。d、取雜交瘤細(xì)胞懸液1ml,加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上e、37C、7.5%濕潤培養(yǎng)7-14天；克隆生長至2mnS寸，用毛細(xì)吸管吸 出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的 24 孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)。f 、吸取上清，檢測(cè)抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存。PS: 1、細(xì)胞融合后，一旦鑒定可以產(chǎn)生目標(biāo)抗體，就應(yīng)立即進(jìn)行克隆化， 確保能分離出單個(gè)細(xì)胞重新形成克隆。2 、經(jīng)多次嘗試，確定修正公式中的 a 值，為以后的實(shí)驗(yàn)提供一個(gè)比 較穩(wěn)定的經(jīng)驗(yàn)入值。3 、應(yīng)在克隆前 1 天制備好飼養(yǎng)細(xì)胞層。五、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采

19、用動(dòng)物體內(nèi)誘生腹水法和體外培養(yǎng)法。1. 用20G或22G的注射針，小鼠腹膜內(nèi)注射降植烷，每只鼠0.5 1 ml, 1 周后接種細(xì)胞。2. 在175 cm2培養(yǎng)瓶中加完全DMEM-10/HEPE丙酮酸鈉培養(yǎng)液，進(jìn)行 雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，使細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期。3. 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入 50 ml 錐形離心管中，室溫下 500 g 離心 5 min。4. 細(xì)胞重懸于50 ml無菌的PBS或 HBSS(不含F(xiàn)BS中洗滌。然后室 溫下 500 g 離心 5 min ，棄上清。重復(fù) 2 次，然后細(xì)胞重懸于 5 ml 的 PBS 或HBSS中。5. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，通過臺(tái)盼藍(lán)染色法確定細(xì)胞活力。6. 用不含F(xiàn)BS的HBSS

20、或PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5 X 102細(xì)胞/ml。7. 用一個(gè)10 ml的無菌的帶22G針頭的注射器，對(duì)裸鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注 射 2 ml 細(xì)胞，等待腹水形成( 12 周)。8. 收獲腹水。( 1 )一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮膚繃緊。(2) 另一只手將一只18G的計(jì)頭插入小鼠腹腔12 cm深。(3) 進(jìn)針部位為左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官，以及 腹中線處的主要大血管。(4) 令腹水滴入一只無菌的 15 ml 聚丙烯錐形離心管中。9. 于室溫下， 1 500 g 離心腹水 10 min ，收集上清，棄沉淀，將腹水 存放于4C,直到收集腹水的工作完成(在1周內(nèi))。10. 再次收

21、獲腹水前，讓小鼠再次積累腹水( 23 天)，具體操作同步驟 8，腹水的加工處理操作同步驟 9。重復(fù)這個(gè)過程直到再?zèng)]有腹水產(chǎn)生可供收 集，或者小鼠健康狀況不佳。11. 把在幾天內(nèi)收集到的腹水匯集到一起，于 56C水浴45 min進(jìn)行熱 處理，如果凝塊形成，可用牙簽挑出除之，然后再離心。12. 采用適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)腹水中的 MAb的效價(jià)。13. 按大于1:10的比例稀釋MAb并進(jìn)行濾過除菌，濾膜孔徑為0.45匕 m分裝并凍存于-70 C,避免反復(fù)凍融，可凍存數(shù)年之久。PS:1、腹水含有大量的油脂、巨噬細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、腹腔內(nèi)的上皮細(xì)胞、血液中的細(xì)胞成份等雜質(zhì)，應(yīng)先離心除去這些成份。2、油脂的密度比較

22、小，一般都漂浮在腹水表面，用槍吸出丟掉即可。六、辛酸-硫酸銨兩步沉淀法純化單抗1、原理在酸性條件下(pH4.5)，非IgG的蛋白成份(包括白蛋白，部分lg),能被辛 酸等短鏈脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要為IgG,再用硫酸銨沉淀上清， 即可獲得純度較高的IgG。辛酸/硫酸銨法比硫酸銨法能夠獲得更高純度的 IgG。2、方法(1) 將腹水用0.06 M醋酸鈉(pH4.0 )按1: 3稀釋，用1mol/L NaOH調(diào) 至血清稀釋液為pH4.5。(2) 室溫下邊攪拌(磁力攪拌器 或電功攪拌器)，邊緩慢滴加辛酸(一般 按每毫升稀釋前的腹水加入40 ul正辛酸)，滴加完后繼續(xù)攪拌30min。(3) 4

23、C 靜置 2 h。(4) 4 C 10000 g離心20min,可見辛酸因溫度低而從系統(tǒng)中結(jié)晶析出漂 浮在腹水上層，用多層紗布過濾，棄去此結(jié)晶以及底部沉淀，收集上清夜。(5) 向上清中加入1/10體積的10X PBS(0.1M, pH 7.4)。(6) 4 C條件下，向其中加入飽和硫酸銨溶液，使終濃度為45%飽和度， 靜置1h以上。(3) 10000 g離心10-20min ;棄上清，將沉淀溶于適量 1沖BS中，再將 其裝入透析袋用10mM的 tris或PBS透析(透析液應(yīng)為抗體體積的100倍以 上，最好攪拌)，4 C過夜。(4) 收集透析好的抗體，直接現(xiàn)用或加入保護(hù)劑和防腐劑長期保存(-20 C 保存或凍干保存)。用這種方法純化出來的抗體純度可達(dá) 80-90%左右，損失較少，對(duì)抗體的 活性損失也較少，試劑成本低，但是操作比較費(fèi)時(shí)。3 、蛋白含量測(cè)定紫外分光光度法測(cè)樣品在波長 260nm 280nm處的I及收光度(A 260, A 28。),