離子交換柱層析分離核苷酸

1、離子交換柱層析分離核苷酸 來源：互聯(lián)網(wǎng) 作者：未知 發(fā)布時間：2006-08-06 一、實驗?zāi)康谋緦嶒炓越湍窻NA為材料，將RNA用堿水解成單核苷酸，再用離子交換柱層析進(jìn)行分離，最后采用紫外吸收法進(jìn)行鑒定。同時通過測定各單核苷酸的含量，可以計算出酵母RNA的堿基組成。本實驗的目的是：1.了解掌握RNA堿水解的原理和方法2.掌握離子交換柱層析的分離原理和方法3.熟練掌握紫外吸收分析方法二、實驗原理1.RNA的堿水解實驗室制備單核苷酸一般用化學(xué)水解法（酸、堿水解）和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤堿基；用堿水解可得到2一核苷酸和3一核苷酸的混合物；用5一磷酸二酯酶或3一磷酸二酯酶水解則

2、分別可得到5一核苷酸或3一核苷酸。RNA用堿水解，經(jīng)過2、3一環(huán)核苷酸中間物，而后水解生成2一核苷酸和3一核苷酸。如下圖所示。堿水解一般采用0.3M的KOH，37保溫1820小時就能水解完全（也可以用1MKOH，80水解60min或0.1MKOH100水解20min）。水解畢，用2MHClO4中和并逐滴調(diào)節(jié)至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，離心去除之。上清液即為各單核苷酸的混合液。然后根據(jù)所選離子交換劑的類型，將上清液調(diào)至適當(dāng)?shù)膒H值，作樣品液備用。一般用陽離子交換劑，pH調(diào)至1.5左右，用陰離子交換劑，pH調(diào)至89(逐滴)。此處用KOH是為了便于除去鉀離子以降低樣品溶液中的離子強(qiáng)度。2.

3、單核苷酸的離子交換柱層析分離離子交換層析是根據(jù)各種物質(zhì)帶電狀態(tài)（或極性）的差別來進(jìn)行分離的。電荷不同的物質(zhì)對離子交換劑有不同的親和力，因此，要成功地分離某種混合物，必須根據(jù)其所含物質(zhì)的解離性質(zhì)，帶電狀態(tài)選擇適當(dāng)類型的離子交換劑，并控制吸附和洗脫條件（主要是洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值）,使混合物中各組分按親和力大小順序依次從層析柱中洗脫下來。在離子交換層析中，分配系數(shù)或平衡常數(shù)（Kd）是一個重要的參數(shù)：Kd=Cs/Cm式中：Cs是某物質(zhì)在固定相（交換劑）上的摩爾濃度，Cm是該物質(zhì)在流動相中的摩爾濃度。可以看出，與交換劑的親和力越大，Cs越大，Kd值也越大。各種物質(zhì)Kd值差異的大小決定了分離的效果。

4、差異越大，分離效果越好。影響Kd值的因素很多，如被分離物帶電荷多少，空間結(jié)構(gòu)因素，離子交換劑的非極性親和力大小，溫度高低等。實驗中必須反復(fù)摸索條件，才能得到最佳分離效果。核苷酸分子中各基團(tuán)的解離常數(shù)（pK）和等電點pI值見表1。表1四種核苷酸的解離常數(shù)（pK）和等電點pI值核苷酸 第一磷酸基pKa1 第二磷酸基pKa2 含氮環(huán)的亞氨基（NH+=）pKa3 等電點pI值*尿苷酸UMP鳥苷酸GMP腺苷酸AMP胞苷酸CMP 1.00.70.90.8 6.46.16.26.3 2.43.74.5 1.552.352.65*注：pI=(pKa1+pKa3)/2由表1可見,含氮環(huán)亞氨基的解離常數(shù)（pK）值

5、相差較大，它在離子交換分離四種核苷酸中將起決定作用。用離子交換樹脂分離核苷酸，可通過調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值使它們的可解離基團(tuán)解離，帶上正電荷或負(fù)電荷。同時減少樣品溶液中除核苷酸外的其它離子的強(qiáng)度。這樣，當(dāng)樣品液加入到層析柱時，核苷酸就可以與離子交換樹脂相結(jié)合。洗脫時，通過改變pH值或增加洗脫液中競爭性離子的強(qiáng)度，使被吸附的核苷酸的相應(yīng)電荷降低，與樹脂的親和力降低，結(jié)果使核苷酸得到分離?；旌虾塑账峥梢杂藐栯x子或陰離子交換樹脂進(jìn)行分離。采用陽離子交換時，控制樣品液pH值在1.5，此時UMP帶負(fù)電，而AMP、CMP、GMP帶正電，可被陽離子樹脂吸附。然后通過逐漸升高pH值，將各核甘酸洗脫下來，次序是U

6、MP-GMP-CMP-AMP。AMP與CMP洗脫位置的互換，是由于聚苯乙烯樹脂母體對嘌呤堿基的非極性吸附力大于對嘧啶堿基的吸附力造成的。本實驗采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季銨堿型粉末陰離子樹脂（2018）分離四種核苷酸.首先使RNA堿水解液中的其它離子強(qiáng)度降至0.02以下，然后調(diào)pH值至6以上，使樣品核苷酸都帶上負(fù)電荷，它們都能與陰離子交換樹脂結(jié)合。結(jié)合能力的強(qiáng)弱，與核苷酸的pI值有關(guān)，pI越大，與陰離子交換樹脂的結(jié)合力越弱，洗脫時越易交換下來。由表1可見，當(dāng)用含競爭性離子的洗脫液進(jìn)行洗脫時，洗脫下來的次序應(yīng)該是CMP、AMP、GMP和UMP。由于本實驗所用的樹脂的不溶性基質(zhì)是非極性的,它與嘌

7、呤堿基的非極性親和力大于與嘧啶堿基的非極性親和力。所以，實際洗脫下來的次序為：CMP、AMP、UMP和GMP。對于同一種核甘酸的不同異構(gòu)體而言，它們之間的差別僅在于磷酸基位于核糖的不同位置上，2磷酸基較3磷酸基距離堿基更近，因而它的負(fù)電性對堿基正電荷的電中和影響較大,其pK值也較大。例如2-胞苷酸的pK1=4.4，3-胞苷酸的pK1=4.3，因此2一核苷酸更易被洗脫下來。應(yīng)注意的是，樣品不易過濃，洗脫的流速不宜過快，洗脫液的pH值要嚴(yán)格控制。否則將使吸附不完全，洗脫峰平坦而使各核苷酸分離不清。3.核苷酸的鑒定由于核苷酸中都含有嘌呤與嘧啶堿基，這些堿基都具有共軛雙鍵（C=CC=C），它能夠強(qiáng)烈地

8、吸收250280毫微米波段的紫外光，而且有特征的紫外吸收比值。因此，通過測定各洗脫峰溶液在220300毫微米波長范圍內(nèi)的紫外吸收值，作出紫外吸收光譜圖，與下圖所示的標(biāo)準(zhǔn)吸收光譜進(jìn)行比較，并根據(jù)其吸光度比值（250nm/260nm,280nm/260nm,290nm/260nm）以及最大吸收峰與下頁“表2”所列標(biāo)準(zhǔn)值比較后，即可判斷各組分為何種核苷酸。根據(jù)各組分在其最大吸收波長（lmax）處總的吸光度（總Amax）以及相應(yīng)的摩爾消光系數(shù)（E260nm）,可以計算出RNA中四種核苷酸的微摩爾數(shù)和堿基摩爾數(shù)百分組成。四種核苷酸在pH=24時的紫外吸收光譜曲線（1）（2）溶液的pH值對核苷酸的紫外吸收光度值影響較大，故測定時需要調(diào)至一定的pH值。三、試劑與器材試