LPA抑制缺氧無血清誘導的大鼠骨髓間充質干細胞凋亡的研究

1、LPA抑制缺氧無血清誘導的大鼠骨髓間充質干細胞凋亡的研究1陳靜海，徐瑞霞，鄧琳子，朱偉銓，叢祥鳳，胡盛壽，陳曦中國醫(yī)學科學院心血管病研究所， 中國協(xié)和醫(yī)科大學阜外心血管病醫(yī)院，北京 (100037)E-mail：摘 要：本研究以缺氧/無血清條件模擬心梗后缺血微環(huán)境，觀察溶血磷脂酸（LPA）抗MSCs凋亡作用。Annexin V/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡，并進一步采用Western blot方法檢測LPA對Akt和ERK1/2的激活作用。結果表明：LPA對缺氧/無血清誘導的MSCs凋亡的抑制作用與阻止caspase-3的活化有關，并且其抗凋亡作用是通過激活PI3K/Akt和MEK/ERK1

2、/2通路實現(xiàn)的。關鍵詞：骨髓間充質干細胞，缺氧/無血清，凋亡，LPA，Akt，ERK1. 引言隨著冠心病發(fā)病率的逐年增高，缺血性心臟病已成為危害人類健康的重大疾病之一。缺血引起的心肌細胞死亡導致斑痕組織形成及心室壁順應性降低，最終降低心功能引發(fā)心力衰竭。近年來，隨著干細胞研究的興起，骨髓間充質干細胞以其具有多向分化潛能、來源充足、體外易擴增、無免疫排異等優(yōu)點，已經成為細胞移植治療心肌梗塞的首選1,2。然而，移植細胞在缺血心肌組織中較低的存活率限制了此方法的臨床治療效果3。如何提高移植細胞的存活率，實現(xiàn)細胞再生、最終改善心功能，是目前細胞移植治療缺血性心臟病亟待解決的問題。溶血磷脂酸（Lysop

3、hosphatidic Acid，LPA）是本課題組一直關注和研究的一種脂類信號分子，我們先前的研究發(fā)現(xiàn)LPA能夠促進心肌細胞肥大4、對心臟成纖維細胞的生長具有雙重調節(jié)作用5。那么，LPA是否能促進MSCs存活呢？本研究旨在以缺氧/無血清條件模擬缺血心肌微環(huán)境誘導MSCs凋亡6，深入探討LPA是否能夠抑制MSCs凋亡，從而為提高移植細胞的存活率、改善臨床治療效果提供實驗依據(jù)和理論基礎。2. 材料與方法2.1 實驗材料SD 大鼠（SpragueDawley rats，二級動物），80g，雌性，購于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心，所有研究都經阜外心血管病醫(yī)院實驗動物委員會批準。2.2 主要試劑及儀器L

4、PA和Hoechst 33342 購自SIGMA公司；特優(yōu)級胎牛血清（FCS）、IMDM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自GIBCO公司；缺氧培養(yǎng)盒（hypoxic GENbox Jar）購自法國 BioMérieux®sa公司；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物公司。Caspase-3酶活檢測試劑盒購自Bivision。 PD98059、U0126、LY294002、Wortmannin、Anti-phospho-Akt、Anti-Akt、 Anti-phospho-ERK和Anti-ERK均購自Cell Signal公司。CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(Napco

5、 5410-220, USA)，熒光倒置顯微鏡（Olympus, JAPAN)，全1本課題得到2006年度教育部博士點基金資助項目（20050023016）的資助。-1-自動酶標分析儀 (Thermo electron corporation Multiskan MK3, USA)， 流式細胞儀（FACSC- LSR，Becton- Dickton，USA)。2.3 實驗方法2.3.1 大鼠骨髓間質干細胞的分離(全骨髓法)動物腹腔麻醉。75%乙醇消毒。在超凈臺內分離腿部肌肉，取出股骨和脛骨。用PBS洗去殘留血液， 剔除骨骼上殘留的骨骼肌，除去長骨兩端的軟骨帽。輕輕刮去一層骨端的骨垢，用完全培養(yǎng)

6、液(含10%FCS的IMEM)緩慢沖出骨髓腔中的細胞，接種培養(yǎng)瓶。原代培養(yǎng)24 h后換液。45天后細胞可達到7080融合，以1：3傳代。13代細胞用于實驗。2.3.2 實驗分組及處理正常對照組：以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（IMDM15FBS）正常培養(yǎng)；凋亡模型組：以無血清（IMDM）及缺氧處理（置于密閉缺氧罐中，內置耗氧劑），37 oC，5CO2孵育6小時；LPA處理組：以不同濃度的LPA（1、10和25µM）預處理MSCs 1小時，然后在缺氧無血清條件下繼續(xù)孵育6小時。加抑制劑組：LPA預處理細胞之前加入MEK1/2抑制劑（PD98059或U0126）或PI3K抑制劑（LY294002或Wo

7、rtmannin）孵育1小時。2.3.3 AnnexinV/PI 雙染流式細胞儀檢測LPA或各種信號通路的抑制劑處理細胞后，取6×105 細胞，胰酶消化。1000rpm, 4,離心5 分鐘，棄上清。細胞用PBS 洗2 次后懸浮于200µL binding buffer。加入10µL 異硫氰酸熒光素（FITC）標記的Annexin-（Annexin-FITC），輕輕混勻，4避光反應1520min。加入5µL PI , 300µL binding buffer，混勻，上流式細胞儀測試，以區(qū)分活細胞、早期和中晚期凋亡細胞及壞死細胞。2.3.4 Cas

8、pase-3活性的檢測各組細胞經LPA處理結束后，收集細胞，提取蛋白，以考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。根據(jù)Caspase-3酶活檢測試劑盒操作，使用酶標儀405nm波長測定Caspase-3活力。2.3.5 Western blot檢測蛋白的表達各組細胞經LPA或各種信號通路的抑制劑處理后，收集細胞，提取蛋白，以考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。按50µg蛋白質量上樣電泳，Western blot檢測caspase-3活化片段、p-ERK和p-Akt的表達水平。3實驗結果3.1 LPA抑制缺氧/無血清誘導的MSCs凋亡流式細胞儀檢測：與凋亡模型組相比較，LPA（1、10和25µM）處理

9、組的細胞早期凋亡率（Annexin V/PI-）及中晚期凋亡率（Annexin V/PI）明顯降低（P<0.05）。（圖1）-2-圖1 流式細胞術檢測LPA的抗凋亡結果3.2 LPA抑制缺氧無血清導致的caspase-3的活化酶標儀測定caspase-3活力(OD405)，結果表明LPA（1、10和25µM）降低缺氧無血清誘導的caspase-3的活性。Western blot 檢測caspase-3活化片段，結果顯示，LPA（1、10和25µM）能明顯減少活化片段的產生，與酶活力檢測一致（圖2）。-3-圖2 A為LPA降低缺氧無血清導致caspase-3酶活性，B為

10、Western Blot方法檢測LPA減少缺氧無血清導致的caspase-3活化片段的生成。3.3 PD98059或U0126抑制LPA的抗凋亡作用流式細胞儀檢測結果顯示，MEK抑制劑PD98059或U0126能明顯抑制LPA的抗凋亡作用。Western blot結果說明LPA能夠時間依賴性的激活ERK1/2：在5分鐘時p-ERK表達開始升高，10分鐘達到高峰，其后表達逐漸降低至基線水平。（圖3）-4-圖3 A為MEK抑制劑PD98059或U0126抑制LPA的抗凋亡作用,B為Western Blot方法檢測LPA激活MEK/ERK1/2信號通路。3.4 LY294002或Wortmannin

11、抑制LPA的抗凋亡作用流式細胞儀檢測結果顯示，PI3K抑制劑LY294002或Wortmannin能明顯抑制LPA的抗凋亡作用。Western blot結果說明LPA能夠時間依賴性的激活Akt：在5分鐘時p-Akt表達開始升高，60分鐘達到高峰，其后表達逐漸降低。（圖4）-5-圖4 A為PI3K抑制劑LY294002或Wortmannin抑制LPA的抗凋亡作用,B為Western Blot方法檢測LPA激活PI3K/Akt信號通路。4討論LPA是結構最簡單的磷脂信號分子，有多種生物學功能，能夠抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡以及促進成纖維細胞的存活7,8。本課題組其它項目研究顯示LPA對正常培養(yǎng)的大

12、鼠心臟成纖維細胞具有雙向調節(jié)作用：既促進其增殖，同時又促進其凋亡5。新近實驗研究觀察到LPA可以抑制缺氧無血清誘導的MSCs凋亡，本文著重研究LPA抗MSCs凋亡作用的信號轉導機制。Caspase-3在凋亡執(zhí)行過程中起著關鍵作用。本實驗結果顯示，LPA能夠降低缺氧無血清誘導的caspase3活性并較少Caspase-3活化片段的表達，進一步確認了LPA的抗凋亡作用是通過阻斷caspase級聯(lián)反應實現(xiàn)的。進一步的信號轉導機制研究表明，LPA通過激活PI3K/Akt和MEK/ERK1/2細胞存活通路從而發(fā)揮其抗MSCs凋亡的作用。本研究結果還具有潛在的臨床應用價值： 本課題組以往研究顯示急性心?；?/p>

13、者血清LPA水平顯著升高9，因此選擇合適的時間點進行MSCs移植，移植入的MSCs可以更有效的利用患者自身的內源性抗凋亡因子對抗缺血引起的凋亡。 MSCs移植前先以LPA預處理，激活促存活通路PI3K/Akt和ERK1/2，然后移植入心梗區(qū)可以提高其存活率。 MSCs移植同時注射LPA以提高微環(huán)境中LPA濃度，提高MSCs的存活?？傊?，本研究對于LPA抗MSCs凋亡作用及其信號轉導機制的報道在國內外尚屬首次，為提高移植MSCs的存活率、改善臨床細胞移植治療缺血性心臟病的療效提供了新的思路，具有潛在的臨床應用價值。-6-參考文獻1 Keating A. Mesenchymal stromal c

14、ells.Curr Opin Hematol.2006,13:419-4252 Krampera M, et al. Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair.Bone. 2006, 39: 678-6833 Geng, Y.J. (). Molecular mechanisms for cardiovascular stem cell apoptosis and growth in thehearts with atherosclerotic coronary disease a

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