線粒體損傷和二苯胺結(jié)構(gòu)在非甾體類抗炎藥引起的肝細(xì)胞損傷中的作用

1、Role of Mitochondrial Dysfunction and Diphenylamine Structure in NSAIDs-induced Hepatocytes InjuryLi yan, Ren jin(Center for Drug Safety Evaluation and Research, Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of SciencesAbstract OBJECTIVE: Evaluate the role of mitochondrial function and struct

2、ure of NSAIDs in NSAIDs-induced liver injury. METHODS: The isolated liver mitochondria and primary rat hepatocytes were prepared to perform all the experiments. Diphenylamine was used as a control drug, which had the shared structure of the NSAIDs used in our studies. RESULTS: Diclofenac and tolfena

3、mic acid could induce cyclosporine A (CsA-sensitive mitochondrial swelling, membrane depolarization and calcium release in isolated mitochondria. However, Diphenylamine had no effects on isolated mitochondria. Dpa, Dcf and Tol all induced mitochondrial dysfunction in hepatocytes, including the decre

4、ase of ATP content and mitochondrial membrane depolarization. CsA could attenuate these effects. Meanwhile, we found that SKF-525A, a nonspecific inhibitor of CYP450, could markedly inhibit the injury induced by Dpa, but not Dcf or Tol. CONCLUSION: Dpa itself could not induce mitochondria injury, th

5、e hepatotoxicity induced by Dpa may be related to its metabolism. And the hepatotoxicity caused by diclofenac and tolfenamic acid could attribute to the mitochondrial dysfunction induced by these drugs instead of the effect of the shared diphenylamine structure of these drugs.Key words: Mitochondria

6、, liver injury, NSAIDs線粒體損傷和二苯胺結(jié)構(gòu)在非甾體類抗炎藥引起的肝細(xì)胞損傷中的作用李妍，任進(jìn)（藥物安全評價(jià)研究中心，上海藥物研究所，中國科學(xué)院，201203）摘要：目的：研究線粒體功能及骨架結(jié)構(gòu)在非甾體抗炎藥引起的肝損傷中的作用。方法：采用離體分離得到的線粒體及原代分離的大鼠肝細(xì)胞，采用多種分子生物學(xué)的方法進(jìn)行研究。結(jié)果：雙氯酚酸鈉和托滅酸可以導(dǎo)致分離線粒體腫脹，膜電位下降和內(nèi)鈣釋放，環(huán)孢菌素A可以明顯的抑制這一過程。二苯胺對分離線粒體則沒有作用。在原代肝臟細(xì)胞上，三者均可以引起肝細(xì)胞線粒體功能損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞ATP含量和線粒體膜電位下降，環(huán)孢菌素A可以改善這一過程。細(xì)

7、胞色素P450非特異性抑制劑可以明顯的抑制二苯胺導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷，而對雙氯酚酸鈉和托滅酸的肝細(xì)胞損傷作用并不明顯。結(jié)論：二苯胺本身并不能引起線粒體損傷，它導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷可能與其代謝有關(guān)，而非甾體類抗炎藥雙氯芬酸鈉和托滅酸引起的肝損傷與線粒體功能異常密切相關(guān)，而與其骨架結(jié)構(gòu)二苯胺關(guān)系不大。關(guān)鍵詞：線粒體、肝損傷、非甾體類抗炎藥非甾體類抗炎藥（Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs）具有抗炎、鎮(zhèn)痛和退熱功效的功效，廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕性疾病如骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等慢性關(guān)節(jié)炎的治療，是臨床應(yīng)用最廣泛的一類藥物。全世界將近有39%的病人使用該類藥物1-

8、3。1988年11月到1991年6月，已經(jīng)有180個(gè)案例報(bào)道雙氯酚酸鈉（Diclafenac, Dcf）引起的副作用可能與肝臟損傷有關(guān)4。1977到1992年，WHO記錄的539起藥物副作用反應(yīng)中，有384起與托滅酸（Tolfenamic acid, Tol）有關(guān)5, 6。NSAIDs所引起的肝臟損傷從輕微的膽汁淤積到嚴(yán)重的肝細(xì)胞損壞等在臨床均有發(fā)生7-9。有一些證據(jù)表明引發(fā)肝損傷的最常見的原因可能是特異體質(zhì)性疾病并伴隨免疫應(yīng)答癥狀（如發(fā)燒，皮疹和嗜伊紅血球增多10-12。近階段的實(shí)驗(yàn)研究在討論NSAIDs引起的肝損傷的機(jī)制時(shí)，主要集中在氧化應(yīng)激、代謝活化和線粒體功能等方面13-16。也有些文

9、獻(xiàn)關(guān)注于NSAIDs引起的肝毒性與結(jié)構(gòu)有關(guān)17-19。有文獻(xiàn)報(bào)道18種NSAIDs對大鼠原代肝細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示細(xì)胞毒較明顯的NSADIs中許多具有二苯胺（Diphenylamine, Dpa）的骨架結(jié)構(gòu)。相同濃度的Dpa可以引發(fā)與Dcf和Tol相同程度的乳酸脫氫酶的泄漏，Dcf和Tol均含有Dpa的骨架結(jié)構(gòu)。因此，Dpa本身被認(rèn)為是Dcf, Tol等藥物產(chǎn)生肝毒性的部分原因17-19。在我們的研究中，著重探討Dcf, Tol引起的線粒體損傷作用是否與Dpa的骨架結(jié)構(gòu)有關(guān)。我們利用分離得到的大鼠原代肝臟細(xì)胞和肝臟線粒體，進(jìn)而研究三種藥物損傷機(jī)制的差別。diphenylamine Diclof

10、enac acid tolfenamic acid圖 1 二苯胺（Dpa）以及與其結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物雙氯芬酸鈉（Dcf）和托滅酸（Tol）的結(jié)構(gòu)式。一、材料與方法1、材料和大鼠肝臟線粒體的提取雙氯芬酸鈉、托滅酸、二苯胺購自Sigma，均用二甲基亞砜（DMSO）溶解。 用差速離心方法分離SD大鼠的肝臟線粒體20。1mg線粒體用1ml的溶液重懸。將線粒體調(diào)整濃度為1.0 mg線粒體蛋白/mL，重懸于反應(yīng)溶液中（210 mmolL-1 mannitol，70 mmolL-1 sucrose，5 mmolL-1 Hepes，PH 7.4），30ºC 孵育，視具體實(shí)驗(yàn)要求加入不同濃度鈣離子溶液。

11、臨實(shí)驗(yàn)前，加入5 mmolL-1 琥珀酸鈉溶液激活線粒體。其他具體實(shí)驗(yàn)條件詳見圖表說明。2 線粒體腫脹檢測按1中條件孵育線粒體，檢測一定時(shí)間內(nèi)，各種作用因素下溶液A540值的變化，指征線粒體體積變化情況。3、線粒體膜電位檢測通過測量TMRE在線粒體上的聚集程度檢測線粒體膜電位的變化。參考Wu文獻(xiàn)中方法21。1.0 molL-1 CsA作為MPT抑制劑用于該實(shí)驗(yàn)中。在激發(fā)波長505 nm，吸收波長535 nm處檢測熒光值。4、原代大鼠肝臟細(xì)胞分離雄性S.D.大鼠，20020g，兩步膠原酶灌流法，分離大鼠肝臟細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。將細(xì)胞濃度調(diào)至3×105 cell/ml，37 oC，5CO2貼

12、壁培養(yǎng)4至6小時(shí)后棄去培養(yǎng)液，加入含15胎牛血清，100 mgL-1青霉素，70 mgL-1鏈霉素，2 mgL-1兩性霉素和2白蛋白的新鮮培養(yǎng)液（F12/DMEM，11混和），培養(yǎng)4小時(shí)后加入不同濃度的藥物。5、細(xì)胞存活率檢測 原代大鼠肝細(xì)胞用雙氯芬酸鈉，托滅酸和二苯胺處理，細(xì)胞存活率用Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan檢測。6、細(xì)胞ATP生物熒光檢測ATP生物熒光試劑購自CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability 試劑盒(Promega, MadiMadison,WI, US

13、A。胞內(nèi)的ATP水平根據(jù)試劑盒的要求測定。生物發(fā)光用熒光儀讀取熒光值 (NOVOstar, BMG LABTECH, Offenburg, Germany。7、細(xì)胞線粒體膜電位的檢測用熒光探針TMRE檢測細(xì)胞中線粒體膜電位的檢測。膜電位的變化用熒光酶標(biāo)儀儀（NOVOstar, BMG LABTECH, Offenburg, Germany）檢測，激發(fā)波長為505 nm，發(fā)射波長為535 nm。8、統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，數(shù)據(jù)計(jì)量資料用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA分析，P<0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二、結(jié)果1. D

14、pa, Dcf, Tol對大鼠肝臟線粒體功能的影響1.1 相同濃度Dpa, Dcf, Tol對大鼠肝臟線粒體腫脹的影響在鈣離子存在的情況下，Tol能夠引起線粒體大幅度的腫脹，Dcf則引起中等程度的腫脹，而Dpa不能引起線粒體腫脹，MPT特異性抑制劑環(huán)孢霉素(cyclosporin A, CsA可以完全抑制Dcf和Tol引起的線粒體腫脹(圖2A。同時(shí)，Dpa對線粒體膜電位幾乎沒有影響，而Dcf和Tol均能使線粒體膜去極化，導(dǎo)致膜電位下降(圖2B。CsA 可以保護(hù)Dcf和Tol所引起的線粒體去極化現(xiàn)象。B圖 2 Dpa, Dcf, Tol對大鼠肝臟線粒體的影響。(ADpa, Dcf和Tol對大鼠肝

15、臟線粒體腫脹的影響。(B Dpa, Dcf和Tol對大鼠肝臟線粒體膜電位的影響。各組均為20molL-1Ca2+存在的條件。所有結(jié)果均至少重復(fù)三次。*P<0.5 和 *P<0.01 表示與對照差異顯著。#P<0.01 表示不加CsA組與加CsA組差異顯著。+P<0.05 和+P<0.01 表示與50molL-1Dpa差異顯著.1.2 相同濃度Dpa,Dcf,Tol對大鼠肝臟線粒體內(nèi)鈣釋放的影響我們檢測了Dpa,Dcf,Tol對線粒體內(nèi)鈣釋放的影響。Dcf可以引起大鼠肝臟線粒體的內(nèi)鈣釋放，1molL-1 CsA可以抑制該現(xiàn)象的發(fā)生。但是Dpa和Tol無法引起線粒體的

16、內(nèi)鈣釋放(圖 2。圖 3 Dpa, Dcf, Tol對大鼠肝臟線粒體內(nèi)鈣釋放的影響。各組均為20molL-1 Ca2+存在的條件。值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。所有結(jié)果均至少重復(fù)三次。*P<0.01 與對照有顯著差異。#P<0.01與不加CsA組有顯著差異。+P<0.01 與50molL-1 Dpa有顯著差異。2. Dpa, Dcf, Tol對大鼠肝臟細(xì)胞的影響2.1 Dpa, Dcf, Tol大鼠原代肝細(xì)胞IC50檢測用系列濃度的Dpa, Dcf, Tol處理大鼠原代肝細(xì)胞，24h后檢測細(xì)胞活性。Dpa, Dcf, Tol的IC50值分別為183.2±6

17、9.58molL-1, 332.7±31.38molL-1, 195.8±19.60molL-1。2.2 Dpa, Dcf, Tol對大鼠原代肝細(xì)胞線粒體功能的影響在原代大鼠肝臟細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，三種藥物均能引起胞內(nèi)ATP含量顯著下降，其中Dpa的作用最顯著(圖3A。同時(shí)，三種藥物均能引起原代大鼠肝細(xì)胞膜電位下降(圖3B。線粒體通透性轉(zhuǎn)換特異性抑制劑CsA可以明顯的抑制三者引起的ATP含量，膜電位下降。SKF-525A是CYP450的廣譜抑制劑。SKF-525A可以明顯的抑制Dpa引起的肝細(xì)胞損傷 (圖3C。C圖4 Dpa, Dcf, Tol對大鼠原代肝細(xì)胞的損傷。大鼠原代肝細(xì)

18、胞分別與Dpa, Dcf, Tol共孵育24h，0.5molL-1CsA作為MPT抑制劑。(A Dpa, Dcf, Tol對肝細(xì)胞ATP含量的影響。(B Dpa, Dcf, Tol對肝細(xì)胞線粒體膜電位的影響。(C SKF-525A對Dpa引起的肝細(xì)胞損傷的影響。肝細(xì)胞與藥物和10molL-1SKF-525A共孵育24h。所有結(jié)果均至少重復(fù)三次。#P<0.05 和#P<0.01 表示與不加CsA的對照組有顯著差異。+P<0.5 and +P<0.01 表示與500molL-1 Dpa有顯著差異。 &&P<0.01 表示與250molL-1 Dpa有顯

19、著差異。三、討論在研究中，我們選擇了兩種具有二苯胺結(jié)構(gòu)的NSAIDs，同時(shí)用二苯胺作為對照藥物研究三者毒性的差別。在分離線粒體上Dcf, Tol均可以引起明顯的線粒體功能損傷，導(dǎo)致線粒體腫脹，膜電位下降和內(nèi)鈣釋放，而Dpa則不能引起分離線粒體的損傷。Dcf與Tol引起的損傷可以被MPT特異性抑制劑CsA所抑制，說明Dcf與Tol引起的分離線粒體損傷與MPT有關(guān)。在大鼠原代肝臟細(xì)胞上，Dpa, Dcf與Tol三者均引起了CsA敏感的肝細(xì)胞線粒體功能損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞ATP含量與膜電位下降，其中Dpa的作用最為顯著。而在細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)中，需要考慮藥物代謝對藥物毒性作用的影響。實(shí)驗(yàn)中我們使用了CYP4

20、50非特異性抑制劑SKF-525A，發(fā)現(xiàn)SKF-525A可以顯著的抑制Dpa引起線粒體功能損傷，而對Dcf與Tol的作用不明顯。因此我們推測Dpa在細(xì)胞水平引起的線粒體功能損傷與其代謝過程密切相關(guān)，Dpa本身可能并不能引起線粒體功能損傷，這與Dpa在分離線粒體上的結(jié)果一致。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)NSAIDs導(dǎo)致的肝細(xì)胞毒性與其線粒體功能損傷作用密切相關(guān)，而它們共有的二苯胺結(jié)構(gòu)在其中的作用可能并不顯著。參考文獻(xiàn)：4 Banks AT, Zimmerman HJ, Ishak KG, Harter JG.Diclofenac-associated hepatotoxicity: analysis of

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