地塞米松對(duì)HUVEC表達(dá)粘附分子的影響

1、    地塞米松對(duì)HUVEC表達(dá)粘附分子的影響        摘要研究地塞米松、rIL-1ra對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子的影響，為炎癥反應(yīng)的病理過(guò)程提供理論依據(jù)。用rTNF、rIL-1和LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），以地塞米松或rIL-1ra處理LPS或rIL-1誘導(dǎo)的HUVEC，采用Cell-ELISA法檢測(cè)粘附分子ICMA-1和ELAM-1的表達(dá)。結(jié)果：rTNF、rIL-1和LPS提高HUVEC表達(dá)ICAM-1和ELAM-1；地塞米松、rIL-1ra抑制rI

2、L-1誘導(dǎo)的粘附分子表達(dá)。表明地塞米松、rIL-1ra以不同機(jī)制抑制HUVEC表達(dá)ICAM-1和ELAM-1。關(guān)鍵詞地塞米松人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）細(xì)胞因子粘附分子中號(hào)R392.11 EFFECTS OF DEXAMETHASONE ON EXPRESSION OF ADHESION MOLECULES BY ACTIVATED HUVECZhang Qingyin，He Weijing，Hou Guihua，Liwei（Affiliated Hospital of Shandong Medical University，Jinan 250012）Abstract In order to

3、 study the effects of Dexamethasone and rIL-1ra on the expression of adhesion molecules by activated endothelial cells，and to provide evidence for pathologic course of inflammatory reactionCell-ELISA method was used to detect ICAM-1 and ELAM-1 expression on human umbilical vein cells（HUVEC） stimulat

4、ed with rTNF、IL-1 and LPSThe results showed rTNF、rIL-1 and LPS could induce the expression of ICAM-1 and ELAM-1 on HUVEC，whereas dexamethasone and rIL-1ra inhibited HUVEC to express ICAM-1 and ELAM-1 on HUVEC induced with rIL-1The findings indicate that Dexamethasone and rIL-1ra might inhibit the ex

5、pression of adhesion molecule ICAM-1 and ELAM-1 by different mechanism respectivelyKey words Dexamethasone，Human umbilical vein endothelial cells（HUVEC），Cytokine，Adhesion molecules炎癥反應(yīng)過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞既可以作為細(xì)胞因子、炎性因子作用的靶細(xì)胞，又可分泌細(xì)胞因子、介導(dǎo)細(xì)胞粘附。中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞穿越內(nèi)皮到達(dá)炎癥部位殺菌消炎與皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子有關(guān)1。細(xì)胞間粘附分子-1（Intercellularadhesionmo

6、lecule-1，ICAM-1）和內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞粘附分子（Endothelialleukocyteadhesionmolecule-1，ELAM-1）均可在活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上表達(dá)。某些研究結(jié)果表明，白細(xì)胞可通過(guò)其表面的配體與ICAM-1及VCAM-1相互作用，粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面2。本研究采用Cell-ELISA法檢測(cè)了粘附分子的表達(dá)，探討內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)的影響因素。1材料和方法1.1材料臍帶標(biāo)本：健康產(chǎn)婦正常分娩后取新生兒臍帶。標(biāo)本取自山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科。試劑：培養(yǎng)基RPMI1640培養(yǎng)液，GIBCO公司產(chǎn)品。內(nèi)含青霉素100Uml，鏈霉素100gml，使用時(shí)加入20新

7、生牛血清。胰蛋白酶，Sigma公司產(chǎn)品，用RPMI1640培養(yǎng)液配成025濃度，rIL-1，10萬(wàn)Uml，rTNF 5萬(wàn)Uml，購(gòu)于北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司。Anti-ICAM-1，12mgml，Anti-ELAM-1，18mgml，BritishBiotechnology（OxfordUK）產(chǎn)品，均為小鼠IgG1。rIL-1ra650gml，北京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室馬大龍教授惠贈(zèng)。地塞米松5mgml，濟(jì)南永寧制藥公司。LPS，5mgml，為Sigma公司產(chǎn)品。1.2方法HUVEC原代培養(yǎng)：將正常分娩12h內(nèi)的臍帶，用pH72的PBS沖洗其靜脈至肉眼無(wú)色為止，然后注入025胰蛋白酶，置37

8、6;C水浴1518min，收集臍靜脈內(nèi)消化液，再用20FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液灌洗。離心后棄上清，以20FCS的RPMI1640制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度分種于1明膠預(yù)包被的96孔板上，置37°C5CO2條件下培養(yǎng)。至形成致密單層后，去除培養(yǎng)上清，沖洗后的HUVEC單層用于ICAM-1和ELAM-1表達(dá)試驗(yàn)。粘附分子ICAM-和ELAM-1表達(dá)的誘導(dǎo)：在含有HUVEC單層的96孔板內(nèi)，分別加入rTNF500Uml，rIL-1100Uml或LPS1gml誘導(dǎo)6h，測(cè)ICAM-1和ELAM-1的表達(dá)。采用rTNF500Uml，rIL-1100Uml，LPS1gml分別和地塞米松1

9、00nM同時(shí)作用HUVEC6h。加不同濃度的地塞米松與1gmlLPS誘導(dǎo)HUVEC6h。rIL-1（1gml）和rIL-1（1gml）地塞米松（10nM）誘導(dǎo)HUVEC6h，測(cè)ICAM-1和ELAM-1表達(dá)。rIL-1ra處理后的HUVEC，然后用rIL-1誘導(dǎo)。ICAM-1和ELAM-1抗原的檢測(cè)3：細(xì)胞因子作用后的HUVEC單層，用pH72的PBS沖洗兩遍，用1戊二醛4°C固定30min，用含005Tween20的PBS洗板3次，用3BSA封閉40min，200l孔，洗板后加入鼠抗人ICAM-1（04gml）或ELAM-1（06gml）單抗，50l孔，37°C置1h，洗

10、板3次后加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG100l孔，37°C1h，預(yù)溫結(jié)束加TBM-H2O2 100 l，37°C顯色15min，加2N H2SO4終止反應(yīng)。450nm處讀取光密度值。實(shí)驗(yàn)測(cè)定OD450刺激組OD450本底對(duì)照OD450。ICAM-1和ELAM-1表達(dá)以下列公式計(jì)算：統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用t檢驗(yàn)2結(jié)果2.1rTNF、rIL-1及LPS對(duì)HUVE表達(dá)ICAM-1和ELAM-1的影響選用rTNF500Uml，rIL-1100Uml，LPS1 gml誘導(dǎo)HUVEC單層6h，測(cè)ICAM-1和ELAM-1的表達(dá)。結(jié)果顯示，3種誘導(dǎo)因子均可明顯誘導(dǎo)2種粘附分子的表達(dá)，明顯高于未刺激

11、的HUVEC（P005）。兩種粘附分子的表達(dá)之間未見(jiàn)明顯差異（P005），見(jiàn)1。1rTNF，rIL-1及LPS對(duì)HUVEC表達(dá)ICAM-1和ELAM-1的影響（n8）Fig1EffectsofrTNF，rIL-1andLPSonexpressionofICAM-1andELAM-1byHUVEC（n8）2.2地塞米松對(duì)rTNF、rIL-1和LPS誘導(dǎo)的HVUEC表達(dá)ELAM-1的影響采用rTNF500Uml，rIL-1 100Uml，LPS1gml，分別和地塞米松100nM同時(shí)作用HUVEC6h，刺激因子誘導(dǎo)的ELAM-1表達(dá)以百分對(duì)照表達(dá)的百分率表示，見(jiàn)2。結(jié)果顯示，地塞米松明顯抑制rIL-

12、1和LPS誘導(dǎo)的ELAM-1表達(dá)。100nM的地塞米松可使rIL-1誘導(dǎo)的ELAM-1表達(dá)下降60；使LPS誘導(dǎo)的ELAM-1表達(dá)降69；而對(duì)rTNF誘導(dǎo)的ELAM-1表達(dá)無(wú)影響。2地塞米松對(duì)rTNF，rIL-1和LPS誘導(dǎo)ELAM-1表達(dá)的影響（n8）Fig2EffectsofDexamethasoneonELAM-1expressioninducedbyrTNF，rIL-1andLPS（n8）2.3地塞米松抑制ICAM-1和ELAM-1表達(dá)的劑量依賴效應(yīng)不同劑量的地塞米松，對(duì)1gmlLPS誘導(dǎo)的HUVEC表達(dá)ICAM-1和ELAM-1分子，表現(xiàn)不同的抑制作用，01nM的地塞米松即可表現(xiàn)明顯

13、的抑制作用，當(dāng)濃度增加至10nM時(shí)，抑制效應(yīng)達(dá)最大值，見(jiàn)3。3地塞米松對(duì)LPS誘導(dǎo)的ICAM-1和ELAM-1表達(dá)的劑量依賴抑制效應(yīng)（n5）Fig3Dose-dependentinhibitoryeffectsofDexamethasoneonexpressionofICAM-1andELAM-1inducedbyLPS（n5）2.4地塞米松對(duì)rIL-1誘導(dǎo)的ICAM-1和ELAM-1表達(dá)的抑制作用rIL-1（1gml）和rIL-1（1gml）地塞米松（10 nM）誘導(dǎo)HUVEC，測(cè)ICAM-1和ELAM-1表達(dá)。結(jié)果顯示，rIL-1和rIL-1地塞米松處理后的ICAM-1和ELAM-1表達(dá)明

14、顯高于單用地塞米松和未誘導(dǎo)組（P005）；rIL-1和rIL-1地塞米松處理后的ICAM-1和ELAM-1表達(dá)表現(xiàn)明顯差異（P005），見(jiàn)4。4地塞米松對(duì)rIL-1誘導(dǎo)ICAM-1和ELAM-1表達(dá)的抑制作用（n8）Fig4InhibitoryeffectsofDexamethasoneontheexpressionofICAM-1andELAM-1（n8）2.5rIL-1ra對(duì)rIL-1誘導(dǎo)的HUVEC表達(dá)ELAM-1的抑制作用不同濃度的rIL-1ra加至HUVEC預(yù)處理10min，然后再加rIL-1 100Uml，6h后測(cè)ELAM-1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明10ngml和100ngml的rIL-1

15、ra不能抑制ELAM-1的表達(dá)，1000ngml時(shí)則表現(xiàn)明顯的抑制效應(yīng)，當(dāng)rIL-1ra濃度增至10000ngml時(shí)，ELAM-1的表達(dá)降至56。LPS誘導(dǎo)的ELAM-1的表達(dá)則不能被rIL-1ra抑制,見(jiàn)表1。表1rIL-1ra對(duì)rIL-1誘導(dǎo)HUVEC表達(dá)ELAM-1的抑制作用Tab1InhibitoryeffectofrIL-1raonELAM-1expressionbyHUVECinducedwithrIL-1rIL-1raconcentration（×103ngml）controlexpression±srIL-1（100Uml）LPS（1gml）001102&#

16、177;28*96±5601105±71*106±391085±55*102±8110056±81*98±117100054±34*102±64*P005；?*P001comparedwithLPS3討論在炎癥組織中，白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生粘附是白細(xì)胞在血管內(nèi)靠邊和游走至血管壁外的前提，也是中性粒細(xì)胞損傷血管內(nèi)皮的基礎(chǔ)，在炎癥過(guò)程中白細(xì)胞粘附穿越內(nèi)皮往往與粘附分子的表達(dá)有關(guān)，在急性炎癥反應(yīng)的早期，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ELAM-1分子，可以和中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞表面的特異性配體結(jié)合，而內(nèi)皮細(xì)胞ICAM

17、-1表達(dá)較晚，主要介導(dǎo)中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的粘附1。內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子在白細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用也有差異，ELAM-1在白細(xì)胞與血管內(nèi)皮初粘附時(shí)起主要作用，ICAM-1與白細(xì)胞表面的CD11CD18配體結(jié)合辯認(rèn)起始結(jié)合位點(diǎn)。單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面的P-selectin與ELAM-1結(jié)合，主要介導(dǎo)這些細(xì)胞沿內(nèi)皮細(xì)胞表面滾動(dòng)，然后白細(xì)胞受趨化因子的激活與ICAM-1發(fā)生強(qiáng)粘附，進(jìn)一步促進(jìn)白細(xì)胞穿越內(nèi)皮2。糖皮質(zhì)類(lèi)固醇是一類(lèi)應(yīng)用廣泛的有效的抗炎藥物，其抗炎機(jī)理尚未完全明了。曾有報(bào)道地塞米松可減少前炎癥細(xì)胞因子的合成5，抑制急性和慢性炎癥反應(yīng)中白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附6，抑制由細(xì)胞因子激活的粘附分子mRN

18、A基因轉(zhuǎn)錄7。我們對(duì)地塞米松調(diào)節(jié)HUVEC粘附分子ICAM-1和ELAM-1表達(dá)作了研究，結(jié)果表明地塞米松可明顯抑制rIL-1和LPS誘導(dǎo)的ICAM-1和ELAM-1的表達(dá)。因此，地塞米松抑制白細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位，可以通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)發(fā)揮作用。IL-1ra由于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HUVEC表面的IL-1受體，而阻斷IL-1的生物學(xué)效應(yīng)。所以用IL-1ra預(yù)處理HUVEC后，rIL-1誘導(dǎo)的ELAM-1表達(dá)可被抑制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明IL-1ra具有抗炎效應(yīng)8。*山東省自然科學(xué)基金會(huì)青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目號(hào)：Q94C0717）作者單位：張慶殷何維敬李偉山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科濟(jì)南 240012

19、候桂華山東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院核醫(yī)學(xué)教研室第一作者：男，33歲，碩士，主治醫(yī)師參考文獻(xiàn)1Pober TS， Cotran RCytokine and endothelial cell BiologyPhysiol Review，1990，704272 Oppenheimer-marks N，Davis LS，Bogue DT，et alDifferential utilization of ICAM-1 and VCAM-1 during the adhesion and transendothelial migration of human T lymphocytes，1991，147：291

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