反義寡核苷酸中殘余硫化劑的測定

1、反義寡核苷酸中殘余硫化劑的測定項目完成人：鄭永紅 魏開華 劉炳玉 宋占軍 張 松項目完成單位：國家生物醫(yī)學(xué)分析中心 反義寡核苷酸即反義核酸（antisense oligonucleotide），其核苷酸序列可與靶RNA或靶DNA互補(bǔ)，抑制或封閉基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，或誘導(dǎo)RnaseH識別并切割mRNA，使其喪失功能。反義核酸藥物是藥理學(xué)的新領(lǐng)域或新革命1，是目前所知最精確、高效及最具廣泛意義的調(diào)控特異基因表達(dá)的潛在策略，它既可以作為研究工具，用于對一些特定蛋白和基因的生理功能的研究，也可作為治療藥物用于癌癥、感染性疾病等許多疾病的治療。然而反義寡核苷酸的功能在很大程度上取決于其穩(wěn)定性、生物利用度及

2、與靶基因結(jié)合特性，通過特定的化學(xué)修飾可以改變這些物理化學(xué)特性，從而增加抗病毒、抗腫瘤和其他特定基因的表達(dá)抑制活性。以硫代磷酸酯為骨架修飾的硫代寡核苷酸（磷酸二酯骨架中的非橋氧原子被硫取代）是最廣泛研究的反義核酸，現(xiàn)在進(jìn)入臨床的所有ODN幾乎都是PS-ODN2，它具有抗核酸酶水解、良好的親核性、方便的同位素標(biāo)記等特點。常見的硫代修飾劑有Beaucage試劑（3H-1,2-Benzodithiol-3-one-1,1-dioxide,簡稱B）和二硫化四乙基秋蘭姆（Tetraethylthiuram disulfide,簡稱T）等，結(jié)構(gòu)式見圖1。然而反義核酸中殘余的硫化劑對反義藥物本身有副作用，對生

3、物體也有一定毒性。因此，在反義寡核苷酸藥物的質(zhì)量控制中需要確定它們的殘余量。BT圖1 硫化劑B和T的結(jié)構(gòu)式1 實驗部分11 儀器與試劑HP 5890氣相色譜儀，配FID檢測器，HP 3394自動積分儀，HP 5971高性能臺式氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有WILLY138譜庫，ZabSpec高分辨磁質(zhì)譜儀，PE 235高效液相色譜儀。標(biāo)準(zhǔn)品B和T購自Sigma公司(純度均大于99%),巰基乙醇為Fluka公司，其它試劑均為色譜純。12 分析條件氣相色譜條件：HP-1非極性柱（30m´0.52mm´0.32mm）；柱溫采用程序升溫：初溫150，保持3分鐘，以10/分鐘升溫至250

4、，保持10分鐘；進(jìn)樣器溫度250；檢測器溫度270；載氣為高純氮，流速1.2mL/min；分流比15：1；分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量體積為1.0mL。氣相色譜-質(zhì)譜條件：HP-5TA柱（30m´0.25mm´0.25mm）；柱溫采用程序升溫：初溫80，以15/分鐘升溫至250，保持10分鐘；進(jìn)樣器溫度250；檢測器溫度280；載氣為高純氦（純度>99.999%），流速32cm/min；柱頭壓11.5psi;分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0mL。電離方式為電子轟擊（EI），接口溫度170，傳輸線溫度250，電子能量70eV, 電子倍增器電壓1.3eV，溶劑延遲3分鐘。 高效液相色譜條件：反

5、相C18色譜柱（250mm´4.6mm, BIO-RAD公司）, 流動相為V（甲醇）:V（水）=70:30的溶液，流速1.0mL/min;檢測波長220nm;柱溫45，進(jìn)樣量50mL。13 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取11.0mg的B置于10mL容量瓶中，用苯定容，配制成1.10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，逐級稀釋至所需要的濃度。同樣，將T配制成1.17mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。14 化學(xué)衍生化取0.5mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入0.5mM的NH4HCO3緩沖液0.5mL，再加入濃度為1.114g/mL的巰基乙醇10mL，在55水浴中反應(yīng)。每隔一小時采樣150mL，立刻冷卻至-20保存，總共采樣6次。

6、將得到的樣品經(jīng)反相HPLC和磁質(zhì)譜檢測。結(jié)果表明反應(yīng)4h時，衍生化進(jìn)行完全，并且試藥與巰基乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為2：1時，衍生化效果最佳 。2 結(jié)果與討論21 氣相色譜條件的優(yōu)化分別用二硫化碳、三氯化碳、丙酮、二氯化碳、四氫呋喃、乙腈和苯作溶劑，樣品在上述溶劑中都有良好的溶解性，但除乙腈和苯之外，在氣相色譜圖上都有溶劑脫尾現(xiàn)象和溶劑對進(jìn)樣針的浸潤作用，故考察選用乙腈和苯作溶劑。又從峰形和測定重復(fù)性方面考察，苯比乙腈的使用效果好，因此，實驗中選用苯作溶劑。選用極性柱HP- INNOWax、中極性柱BP-225和非極性柱HP-1三種氣相色譜柱進(jìn)行實驗，均可進(jìn)行檢測。但使用前二種色譜柱，色譜峰拖尾比較嚴(yán)

7、重，因此會影響分析方法的精密度和線形范圍。使用后一種色譜柱HP-1能夠克服這一不足?？疾炝撕銣睾统绦蛏郎囟N情況，在分離度和最低檢測限量方面，程序升溫好于恒溫，并經(jīng)反復(fù)實驗比較不同升溫方式，確立最佳升溫程序。同時，在選擇初始柱溫時，既要考慮能縮短分析周期，又要考慮被檢測物的靈敏度。當(dāng)該溫度在100150時，單位進(jìn)樣量的峰高基本不變，但當(dāng)該值大于150時，色譜峰明顯拓寬，峰高度顯著降低。因此，初始柱溫選擇150比較合適。22 氣相色譜-質(zhì)譜的測定將B和T的衍生化樣品分別進(jìn)行GC/MS全掃描分析，質(zhì)譜圖見圖2和圖3。由圖2、圖3可知，B和T 的基峰分別為168和116。分別以m/z 168, m/

8、z 116的離子作為特征目標(biāo)監(jiān)測離子，同時以保留時間及WILEY138譜庫的檢索結(jié)果對樣品做進(jìn)一步確證，確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。23 檢出限與線性范圍B和T標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖4和圖5。為了確定它們的最低檢測限量和線性范圍，對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，得到了不同進(jìn)樣量的色譜峰面積及峰高。以色譜峰高度是基線噪聲高度的2倍作為標(biāo)準(zhǔn)計算最低檢測限量，則B的最低檢測限量為50mg/mL, T的最低檢測限量為100mg/mL。兩種硫化劑的線性回歸方程如下：B：Y=14228X-248846,r=0.995;T: Y=13158X-343695,r=0.998其中X為進(jìn)樣量，Y為色譜峰面積，線性范圍：150mg

9、/mL1100mg/mL。3 結(jié)語反義寡核苷酸是一類新型藥物，有關(guān)研究歷史不長，特別是還未建立系統(tǒng)的藥物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)與檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)。測定反義寡核苷酸中殘余硫化劑，由于課題工作量大，多步驟展開研究，因此，研究時間緊張。本課題研究了二類最常用硫化劑，尚有其它硫化劑未涉及，還有待繼續(xù)研究。參考文獻(xiàn)1Sommer W,Heillig M.Antisense oligonucleotides are clinically tested.Lakartidnin Gen,1999,96(4):348354.2Weiss B,Davidkava G,Zhou LW,et al.Antisense RNA ge

10、ne therapy for studying and modulating biological processes.Cell Mol Life Sci,1999,55(3):334358.3Antisense 98:Work progress.Nature Biotech,1998,16(13):13191321.4Kamlesh J,Padiya and Manikrao M.Liquid phase oligonucleotide synthesis by alkyl H-phophonate approach.Bio Med Chem,2000,8:337342.5Branch AD

11、.A good antisense molecule is hard to find.Trends Biochem Sci, 1998,23:4550.6108.73008.8Moring,S.E.,and Colburn,J.C,etal.Analytical aspects of an automated capillary electrophoresis system.LC·GC,1990,8:349Krisztina Pongracz and Sergei Gryaznov.Oligonucleotide N3'®P5thiophosphoramidates:synthesis and properties.Tetrahedon Lett, 1999(40):76617664.101254.1112 M.Vaman Rao,Colin B.Reese and Zhao zhengyun.Dibenzoyl tetrasulphide-A rapid sulfur transfer agent in the synthesis of phosphorothioate analogues of oligonucleotides.Tetrahedron Lett,1992,33:48394842.13676