幾種高溫浸礦菌的分離鑒定及其應用基礎(chǔ)與浸礦潛力研究

1、幾種高溫浸礦菌的分離鑒定及其應用基礎(chǔ)與浸礦潛力研究本論文根據(jù)不同高溫環(huán)境樣品的理化性質(zhì)和目標菌株的生理生化特性,對不同溫度級的高溫浸礦菌進行了系統(tǒng)的富集、分離和鑒定,并對所分離的高溫浸礦菌株進行了應用基礎(chǔ)和浸礦潛力研究,以期為我國高溫浸礦菌種資源庫的建立提供菌種資源,為高溫浸礦菌的基礎(chǔ)和應用研究提供優(yōu)良出發(fā)菌株。作者從我國不同地域采集到各種環(huán)境樣品14份,共從中分離鑒定出各類高溫菌6屬6種30余株,包括喜溫嗜酸硫桿菌（Acidithiobacilluscaldus）21株（最適生長溫度35-55）、嗜熱硫氧化硫化桿菌（Sulfobacillusthermosulfidooxidnas）1株（最

2、適生長溫度53）、仙臺脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillussendaiensis）1株（最適生長溫度55）、萬座酸菌（Acidianusmanzaensis）2株（最適生長溫度65）、金屬硫葉菌（Sulfolobusmetallicus）2株（最適生長溫度67）和勤奮金屬球菌（Metallosphaerasedula）3株（最適生長溫度66.5）。在所有分離鑒定的高溫菌中,除仙臺脂環(huán)酸芽孢桿菌外,其它菌株均具有浸礦功能。由于篇幅所限,本論文只涉及到其中的前四屬四種,即喜溫嗜酸硫桿菌、嗜熱硫氧化硫化桿菌、仙臺脂環(huán)酸芽孢桿菌和萬座酸菌。本論文對上述四種高溫菌的研究主要包括如下內(nèi)容。1）

3、喜溫嗜酸硫桿菌的分離鑒定使用多種培養(yǎng)基,采用瓊脂平板固體分離法從樣品中分離到喜溫嗜酸菌21株。經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特性研究及16SrRNA基因序列分析,鑒定這21個菌株為喜溫嗜酸硫桿菌。根據(jù)樣品來源,將這些菌株分為5個系列,即“YN”系列（來自云南騰沖、新華、瑞甸酸性熱泉），"AN'系列（來自云南安寧酸性溫泉），TW系列（來自臺灣陽明山酸性熱泉）“JX”和"DE?系列（分別來自江西德興、廣東大寶山酸性礦山廢水）。2）喜溫嗜酸硫桿菌菌株隨機擴增DN夠態(tài)性分析21株喜溫嗜酸硫桿菌來自多個地理位置相互隔離,物理化學性質(zhì)各異的環(huán)境樣品,雖然同屬一種,但有些菌株在生理生化特性

4、上表現(xiàn)出較大的差異。為揭示這些菌株之間的親緣關(guān)系以及菌株差異性和環(huán)境條件之間的關(guān)聯(lián),從而為高效浸礦菌株的選育提供理論依據(jù),作者在國內(nèi)外首次運用隨機擴增DN夠態(tài)性（RAPD技術(shù)對這些菌株進行了多態(tài)性分析。結(jié)果表明這21個菌株可以分成三組,菌株分異主要與棲息環(huán)境的化學特性有關(guān)。硫、鐵、銅、鋁、鎢、鋅、鎂、錳是影響菌群分異的主要因素,其中硫是關(guān)鍵元素。3） 喜溫嗜酸硫桿菌菌株的重金屬抗性研究國內(nèi)外有關(guān)喜溫嗜酸硫桿菌對有毒離子的抗性研究多集中于砷。有關(guān)喜溫嗜酸硫桿菌對其它有毒離子,特別是重金屬離子抗性的研究報道較少。研究喜溫嗜酸硫桿菌對重金屬離子的抗性,對于提高其浸礦效率具有十分重要的意義。作者根據(jù)喜

5、溫嗜酸硫桿菌菌株的來源,選擇了10個菌株和5種重金屬硫酸鹽,對所選菌株進行了重金屬抗性研究。結(jié)果顯示，YN12菌株對Zn²⁺、Cd<sup>2+</sup環(huán)口Co²⁺6勺初始而寸受濃度最高，對YN12的抗Cd²⁺|g力進行進一步的馴化增強后，其最終Cd<sup>2+</sup對受濃度達到罕見的210g-L^-13CdSO₄8H<

6、sub>2</sub>O伸當于31.5gL^-1Cd²⁺）,是目前所報道的抗Cd²⁺能力最強的菌株；DB2菌株對Cu²⁺!勺初始而寸受濃度最高；而YN2對Ni²⁺的初始耐受能力最強。4）嗜熱硫氧化硫化桿菌的分離鑒定根據(jù)嗜熱硫氧化硫化桿菌能產(chǎn)生內(nèi)生孢子,以抵抗不利環(huán)境的特點,本文作者采用前期以該菌的最適生長條件促進其營養(yǎng)生長,后期以該菌的臨界生長條件促進

7、其孢子生成的方式對該菌進行富集,最后采用促進營養(yǎng)生長的方式對該菌進行稀釋分離,成功地從取自云南,pH4.5、溫度約60的酸性熱泉水樣中分離到一株最適生長溫度53C,最適生長pH1.5（Fe²⁺培養(yǎng)基）或2.5（S⁰培養(yǎng)基）的桿狀細菌YN22。經(jīng)形態(tài)學、生理生化、分子生物學等方面的詳細研究，確認YN22屬于嗜熱硫氧化硫化桿菌。這是國內(nèi)首次分離,并經(jīng)多種方法鑒定、確認的嗜熱硫氧化硫化桿菌。5）嗜熱硫氧化硫化桿菌YN22菌株作用下形成的鐵磯沉淀及其對該菌的影響為了解嗜熱硫氧化硫化桿菌作用下鐵礬沉淀形成的規(guī)律以

8、及鐵礬沉淀對該菌生長的影響,從而為該菌浸礦參數(shù)的優(yōu)化提供理論依據(jù),作者在該菌最適生長條件下,在加或不加玻璃珠的培養(yǎng)基中,得到鐵礬沉淀。加玻璃珠和不加玻璃珠兩組間在Fe²⁺氧化速率、沉淀產(chǎn)量和菌群密度上有顯著差異，加玻璃珠一組Fe²⁺氧化速率快6h,沉淀出現(xiàn)時間早6h,沉淀產(chǎn)量高78%X衍射圖譜、紅外吸收光譜、能譜和掃描電鏡圖像揭示這兩種沉淀都是黃鉀鐵礬和黃銨鐵礬的混合物,形態(tài)上與后者相似。在未接種的加玻璃珠和不加玻璃珠對照組中,實驗期間均無沉淀生成。產(chǎn)自不加玻璃珠組的沉淀對YN22菌株的生長和Fe<

9、;sup>2+</sup>氧化能力沒有明顯影響，而產(chǎn)自加玻璃珠組的沉淀在濃度達到4gL^-1時就會對YN22菌株的生長和Fe²⁺氧化能力造成明顯的抑制作用。實驗結(jié)果提示,YN22用于實際浸礦,特別是用于攪拌式槽浸時,為防止鐵磯沉淀的過早出現(xiàn)和過度累積，在其它參數(shù)較難調(diào)控的情況下，應將浸礦體系的pH控制在較低的合適范圍內(nèi)。6）嗜熱硫氧化硫化桿菌YN22菌株對黃銅礦和黃鐵礦的浸出到目前為止，國內(nèi)尚未見嗜熱硫氧化硫化桿菌浸出黃銅礦的報道。為評估在浸礦潛力,作者研究了YN22菌株純菌以及和喜溫嗜

10、酸硫桿菌混合對黃銅礦和黃鐵礦的浸出。結(jié)果顯示,YN22菌株單獨浸出黃銅礦的效率較低,25d銅的浸出率為14.7%。當YN22菌株與適度嗜熱硫氧化菌一喜溫嗜酸硫桿菌YN21株?M合,浸礦效率大大改善,同期銅的浸出率提高到46.2%。YN22菌株對黃鐵礦的浸出效果較好,經(jīng)過25d的浸出,純菌浸出液中總鐵濃度達到5292mgL^-1,是無菌浸出液的4.73倍。研究結(jié)果提示，用YN22菌株浸出黃銅礦一類的原生硫化礦時，最好與適度嗜熱硫氧化菌混合。7）異養(yǎng)菌YNTC-1的分離鑒定及其對YN228株浸礦的影響為了解共棲異養(yǎng)菌對嗜熱硫氧化硫化桿菌浸礦的影響，從分離

11、YN22菌株的富集物中分離鑒定了一株與YN22共棲的專性異養(yǎng)菌YNTC-1,并禾I用Ig菌與YN2純合，進行了黃銅礦和黃鐵礦的浸礦試驗?；诒硇?、基因型和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,YNTC-1菌株被鑒定為仙臺脂環(huán)酸芽孢桿菌一新菌株。用YN22純菌以及YN22與YNTC-1混合菌對黃銅礦和黃鐵礦進行的浸礦實驗表明,YNTC-1菌株對這兩種硫化礦的浸出沒有明顯的促進作用。8）萬座酸菌的分離鑒定運用原位富集法對云南騰沖的酸性熱泉水樣進行富集后,在實驗室成功分離純化了2株嗜熱喜酸菌YN25、YN26。經(jīng)多種方法詳細鑒定,確認兩個菌株屬于嗜熱古菌萬座酸菌。萬座酸菌是新近發(fā)現(xiàn)的酸菌屬新種,目前全世界僅有3個菌株,即模式菌株NA-1^T和我們自云南酸性熱泉中分離的YN25和YN26兩個菌株。YN25?口YN2恥國內(nèi)首次分離鑒定的萬座酸菌菌株,該研究成果對于推動我國浸礦菌種,特別是高溫浸礦菌種的基礎(chǔ)和應用研究具有重要意義。9)萬座酸菌YN25®株對黃銅礦和黃鐵礦的浸出萬座酸菌YN25®株對黃銅礦和黃鐵礦的浸出實驗表明,該菌株是目前已報道的浸礦菌中浸礦能力最強的菌株之一。黃銅礦的搖瓶實驗結(jié)果顯示,24d銅的浸出率達到79.16%。對黃銅礦的繼代浸出實驗進一步表明,通過Cu<sup>2+</sup關(guān)向馴化,YN25菌株對Cu&