骨形成蛋白在脛骨截骨快速延長成骨過程中的表達(dá)及意義(一)

1、骨形成蛋白在脛骨截骨快速延長成骨過程中的表達(dá)及意義(一)作者：范國華，林月秋，李主一，周仲英 【關(guān)鍵詞】 骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類Expression of bone morphogenetic protein and its significance during distraction osteogenesis following tibial osteotomy【Abstract】 AIM: To study the expression of bone morphogenetic protein(BMP) and its significance during distraction ost

2、eogenesis. METHODS: Rabbits were used to make the models of tibial lengthening by osteotomy and distraction and sacrificed at 5, 10, 15, 20, 30 and 40 d after the interventions. BMP at the margins of bone formation in different time periods of tibial lengthening was detected immunohistochemically us

3、ing monoclonal antibody against BMP. RESULTS: There was a persistent expression of BMP in the whole course of bone lengthening, but the position of BMP expression varied in different time periods. The expression of BMP can be found in most of the cells and tissues except inflammatory cells, osteoid

4、and trabecular bone. There was a high level expression of BMP in mesenchymal cells, chondrocytes, osteoblasts, osteocytes and marrow cells. CONCLUSION: BMP plays an important role in the course of distraction osteogenesis. The deficiency of BMP may be a main reason for bone nonunion in distraction o

5、steogenesis.【Keywords】 bone morphogenetic proteins; osteogenesis, distraction; bone regeneration; bone nonunion【摘要】 目的： 探討快速延長成骨過程中骨形成蛋白（BMP）的表達(dá)及意義. 方法： 制作兔脛骨截骨快速延長動物模型，分別于延長第5, 10, 15, 20, 30和40日在延長區(qū)取材，以抗骨形成蛋白單克隆抗體(BMPMcAb)行SP法免疫組化染色光鏡觀察. 結(jié)果： 在骨延長的整個過程中均有BMP的表達(dá)，不同時相BMP表達(dá)的部位不同. 除炎癥細(xì)胞、類骨樣組織及骨小梁外，幾乎所有

6、細(xì)胞及組織均有BMP存在. 間充質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞BMP呈高表達(dá). 結(jié)論： BMP在骨延長成骨過程中發(fā)揮著重要作用. BMP表達(dá)量不足可能是導(dǎo)致快速骨延長骨不連接的重要因素.【關(guān)鍵詞】 骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類；骨生成，內(nèi)脫位；骨再生；骨不連接0引言自1905年Codivilla首次報道應(yīng)用截骨術(shù)后分次牽開的方法施行股骨持續(xù)延長術(shù)以來，骨延長技術(shù)在臨床得到了廣泛應(yīng)用. 尤其是蘇聯(lián)學(xué)者Ilizarov研究發(fā)現(xiàn)了組織牽張再生規(guī)律、提出了骨骼延長技術(shù)的生物學(xué)和力學(xué)原則以后，骨延長已經(jīng)成為現(xiàn)代矯形外科治療各種骨折不連接、骨缺損等的重要手段1-2. 然而延長術(shù)自身存在的各種并發(fā)癥嚴(yán)重

7、影響其臨床應(yīng)用及治療效果2-3. 現(xiàn)有研究已經(jīng)證實3-6，骨折愈合過程中有多種骨生長因子參與，其中骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP) 是近年來最為引人注目的一組新型骨生長因子，在骨折愈合過程中發(fā)揮著重要作用，且應(yīng)用外源性BMP可大大縮短骨折愈合所需時間并提高新生骨的質(zhì)量. 骨延長是一種特殊形式的骨折，BMP在骨延長過程中的表達(dá)、作用及潛在應(yīng)用前景已成為目前研究熱點2-3,10. 我們應(yīng)用抗骨形成蛋白單克隆抗體(BMPMcAb)研究了兔脛骨截骨快速延長成骨過程中BMP的表達(dá)，并就BMP在骨延長區(qū)骨愈合過程中的作用作了初步探討.1材料和方法1.1材料選用3

8、 mo齡清潔級健康日本大耳白兔18只，均為雌性，體質(zhì)量2.02.3（平均2.1） kg. 每只兔右后肢為手術(shù)延長側(cè)，左后肢為自身正常對照. 制作右脛骨干中下1/3處截骨延長模型. 術(shù)后第4日開始延長，延長速度2.0 mm/d，分兩次完成，共延長10 d. SP免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)公司). 抗骨形成蛋白單克隆抗體(BMPMcAb 150第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室).1.2方法分別于延長第5, 10, 15, 20, 30和40日隨機(jī)抽取3只動物，空氣栓塞致死后完整切取兩截骨端間骨延長區(qū)新生骨組織，固定于10 g/L福爾馬林溶液、4保存2448 h, 4低溫下以5 g/L硝酸脫

9、鈣，流水沖洗、修塊，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋并切片，以抗骨形成蛋白單克隆抗體(BMPMcAb)為標(biāo)記物，行SP法免疫組化染色，光鏡觀察延長區(qū)骨愈合過程中BMP的分布及細(xì)胞定位情況. BMPMcAb為小鼠IgG2a，工作濃度150. 切片常規(guī)脫蠟，3 g/L H2O2孵育5 min，蒸餾水沖洗并PBS浸泡5 min，滴加10 g/L正常山羊血清室溫放置10 min，傾去血清后加入BMPMcAb，另設(shè)空白對照和陰性對照，4濕盒內(nèi)過夜，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG 37孵育30 min, PBS沖洗33 min，辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素37孵育30 min，PBS沖洗33 m

10、in，加0.01 g/L DAB顯色3 min，自來水沖洗中止反應(yīng)，常規(guī)蘇木素復(fù)染，脫水、透明、吹干、封片后光鏡下觀察. 陽性結(jié)果為組織及細(xì)胞中出現(xiàn)棕色著色.2結(jié)果2.1動物情況全部動物術(shù)畢麻醉清醒后均恢復(fù)正常生理活動(如飲水、磨牙等)，傷肢即能輕度著地負(fù)重，睡眠及休息時采取左側(cè)臥位. 18只動物均存活至預(yù)定觀察時間，整個實驗過程未發(fā)生克氏針針道感染跡象. 全部動物均順利延長，其中15只觀察時間滿10 d以上并完成了預(yù)定延長期. 延長期間，后肢延長側(cè)肢體長度較對側(cè)逐漸增加，延長區(qū)皮膚緊張，平均延長長度（20.20.8） mm，延長幅度為原脛骨長度的（19.550.08）%.2.2延長區(qū)新骨組織

11、形態(tài)學(xué)檢查A： 軟骨內(nèi)化骨區(qū)；B： 膜內(nèi)化骨區(qū).圖1延長15 d BMP均呈高表達(dá)SP 200（略）20 d延長區(qū)兩端類骨樣組織與軟骨性骨痂交互聯(lián)接成片網(wǎng)狀幼稚的骨小梁，順應(yīng)力方向縱向排列，中央纖維組織生長帶廣泛. 除大量的纖維組織及間充質(zhì)細(xì)胞BMP表達(dá)陽性外，骨小梁表面的骨細(xì)胞、小梁邊緣成行排列的成骨細(xì)胞及網(wǎng)腔內(nèi)的疏松纖維組織均呈BMP強(qiáng)陽性. 纖維組織內(nèi)新出現(xiàn)的類骨樣組織有時可見強(qiáng)弱不一的棕色染色. 偶見BMP高表達(dá)的軟骨內(nèi)化骨灶附近部分軟骨細(xì)胞無BMP表達(dá). 延長區(qū)中央染色陽性的間充質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少. 30 d見小梁骨纖細(xì)，其間纖維組織和成骨細(xì)胞多，小梁基質(zhì)內(nèi)可見鈣鹽沉積. 為數(shù)不多的破骨

12、細(xì)胞開始出現(xiàn)，新生骨改建開始. BMP表達(dá)陰性的片網(wǎng)狀骨小梁偏心性存在于延長區(qū)兩端，其間BMP陽染的纖維組織、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞數(shù)量多，部分骨小梁網(wǎng)腔內(nèi)因纖維降解而呈BMP陰性表達(dá). 破骨細(xì)胞胞漿也含有少量的BMP. 陽染的纖維組織仍大量存在，而BMP高表達(dá)的間充質(zhì)細(xì)胞數(shù)量不多. 40 d見偏心性生長的骨小梁內(nèi)，BMP高表達(dá)的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞仍大量存在. 新形成的骨髓腔內(nèi)，骨髓細(xì)胞和纖維組織 BMP陽性. 延長區(qū)內(nèi)陽染的纖維組織數(shù)量仍多，中央部分呈明顯的陽性著色區(qū)域. 新出現(xiàn)的軟骨灶和膜性成骨區(qū)BMP表達(dá)陽性.3討論骨延長是一個在機(jī)械牽張應(yīng)力刺激下的特殊骨再生技術(shù)，其骨再生修復(fù)涉及多種骨生長因子

13、、細(xì)胞因子和激素的相互作用和網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)2-3,10. BMP是迄今發(fā)現(xiàn)的最重要的骨生長因子之一，能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化1,3,6,10. 本實驗組織學(xué)觀察顯示，在延長期延長區(qū)域主要以血腫機(jī)化為主，而延長固定初期即出現(xiàn)牽張骨再生修復(fù)的特征性成骨模式軟骨內(nèi)化骨與膜內(nèi)化骨同時存在、成熟骨小梁與新生幼稚骨組織并存、各階段成骨細(xì)胞及成骨前體細(xì)胞共存，這與文獻(xiàn)7-9,11報道相一致. 免疫組化觀察顯示在骨延長整個過程中均有BMP的表達(dá). 延長區(qū)除炎性細(xì)胞以外，幾乎所有細(xì)胞均有不同程度的BMP表達(dá). 軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)、成纖維樣間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、降解變性之紅細(xì)胞甚

14、至破骨細(xì)胞均有強(qiáng)弱不等的BMP存在. 隨著骨化進(jìn)程，BMP表達(dá)亦減少，類骨樣組織及成熟骨小梁基本不含BMP，但存在其間的成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞及髓腔內(nèi)纖維組織仍有BMP的表達(dá). 富含BMP的成纖維樣間充質(zhì)細(xì)胞在延長各個時相點均存在，只是隨著延長骨的逐漸成熟，其細(xì)胞數(shù)量亦減少. 由截骨斷端降解脫落的骨碎片在初期富含BMP，但隨骨延長進(jìn)程其BMP含量迅速下降，說明每天延長造成的骨痂骨折即骨斷端骨組織細(xì)胞降解釋放出的BMP在延長區(qū)骨愈合過程中也起著非常關(guān)鍵的作用. 實驗觀察到，在任一時間點延長區(qū)周圍的骨膜均保持完整、無撕裂且明顯增厚. 這種完整的骨膜形成一個閉合空腔，有利于延長區(qū)域局部BMP 濃

15、度的聚集和提高. 實驗結(jié)果提示BMP在牽張骨延長成骨過程中發(fā)揮著重要作用，與Rauch等9和Campisi等10的報道一致.已有的研究證實7,9,11，以兔為實驗性脛骨截骨延長動物模型，當(dāng)每日的延長速度超過2.0 mm時，延長區(qū)骨愈合將呈現(xiàn)骨不連接或延遲愈合. 本實驗選擇了2.0 mm/d的快速脛骨截骨延長動物模型，結(jié)果證實延長40 d即固定期30 d時兔脛骨截骨延長區(qū)域均呈現(xiàn)了骨不連接. 既然富含BMP的各種成骨細(xì)胞及成骨前體細(xì)胞在延長區(qū)任一時相點均存在，而且在延長成骨的全過程中都有BMP的高水平表達(dá)，為什么每日2.0 mm的延長速度會導(dǎo)致延長區(qū)域的骨不連接？是否由于快速骨延長過程局部BMP

16、表達(dá)量仍不足？可否應(yīng)用外源性BMP來提高延長區(qū)成骨的速度與質(zhì)量以及何時以何種方式補(bǔ)充BMP等問題仍值得進(jìn)一步研究探討.【參考文獻(xiàn)】1 Rodeo SA, Hidaka C, Maher SA. Whats new in orthopaedic research J. J Bone Joint Surg Am, 2005,87:2356-2365.2 DeCoster TA, Gehlert RJ, Mikola EA, et a1. Management of posttraumatic segmental bone defects J. J Am Acad Ortho Surg, 2004,

17、12:28-38.3 Termaat MF, Den Boer FC, Bakker FC, et al. Bone morphogenetic proteins. Development and clinical efficacy in the treatment of fractures and bone defects J. J Bone Joint Surg Am, 2005,87:1367-1378.4 Mont MA, Ragland PS, Bridget B, et al. Use of bone morphogenetic proteins for musculoskelet

18、al applications: An overview J. J Bone Joint Surg Am, 2004,86:41-55.5 郭繼東，孫大銘. BMP基因治療與骨修復(fù)J. 中國矯形外科雜志, 2003,11(21):1497-1498.6 彭吾訓(xùn)，龔躍昆，李世和，等. BMP在骨科領(lǐng)域中的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展J. 中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志,2005,3(3):215-218.7 Li G, Bouxsein ML, Luppen C, et al. Bone consolidation is enhanced by rhBMP2 in a rabbit model of distraction osteogenesis J. J Orthop Res, 2002,20:779-788.8 Edwards RB, Seeherman HJ, Bogdanske JJ, et a1. Percutaneous injection of recombinant human bone morphogenetic protein2 in a calcium phosphate paste accelerates healing of a canine tibial osteotomy J. J Bo