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文檔簡(jiǎn)介
1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書實(shí)驗(yàn)一 細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞器的觀察一、實(shí)驗(yàn)類型驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、觀察各種不同細(xì)胞的形態(tài)大小,從而對(duì)細(xì)胞的分類,進(jìn)化及分化有所了解。 2、 判斷和識(shí)別光學(xué)顯微鏡下各種細(xì)胞器的形態(tài), 大小和數(shù)目。三、預(yù)習(xí)要求 了解顯微鏡的組成原理及使用方法,預(yù)習(xí)各種細(xì)胞及其細(xì)胞器的形態(tài)大小、數(shù)目、分布特點(diǎn)。四、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞是構(gòu)成生物有機(jī)體最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位,其物種、部位和功能的不同在形態(tài)與大小上也呈現(xiàn)一些區(qū)別。由于細(xì)胞比較小,細(xì)胞器大部分在 0.1m 和10m 之間,而光學(xué)顯微鏡的最高分辨率為 0.2m,所以我們要借助于顯微鏡才可以觀測(cè)出細(xì)胞形態(tài)大小的差異。每種細(xì)胞器都有特殊的形態(tài)、大
2、小、分布位置及數(shù)目,并且通過(guò)特異性染色方法可把細(xì)胞器各種特殊結(jié)構(gòu)區(qū)分開(kāi)來(lái),這也是我們判斷和識(shí)別細(xì)胞器的依據(jù)。另外,細(xì)胞器在不同細(xì)胞、不同發(fā)育時(shí)期和不同生理狀態(tài)下的形態(tài)大小也會(huì)有所不同。因此,對(duì)細(xì)胞器的觀察可用來(lái)判斷細(xì)胞的生理和發(fā)育情況。在取材和觀察上要注意各種細(xì)胞器在不同細(xì)胞中的特殊性。不同細(xì)胞的形態(tài)大小可以借用目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行測(cè)量。測(cè)微尺分物鏡測(cè)微尺(簡(jiǎn)稱物微尺或臺(tái)微 尺)和目鏡測(cè)微尺(簡(jiǎn)稱目微尺),兩者配合使用,可以測(cè)量細(xì)胞大小。目微尺是一個(gè)可以放在目鏡內(nèi)的特制玻璃圓片,圓片中央刻有一條直線,此線分為若干格。 物微尺為一載玻片中央封固的小尺,長(zhǎng)1mm,被等分為100格,長(zhǎng)為0.0
3、1mm(10m)。當(dāng)測(cè)量細(xì)胞大小時(shí),不能用物微尺直接測(cè)量細(xì)胞,而只能使用 目微尺。因目微尺測(cè)量的細(xì)胞是經(jīng)物鏡放大后的像,而它每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度隨物鏡的放大率而變,在測(cè)量時(shí)需要先用物微尺來(lái)標(biāo)定,求出某一放大率時(shí)目微尺每 格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度,然后再用以測(cè)定細(xì)胞大小。將物微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上,小心轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺,移動(dòng)物微尺使兩尺平行,起點(diǎn)線重合,然后找出另一處兩尺刻度重合處,記錄起點(diǎn)線到重合線之間的各尺的刻度數(shù)(格數(shù)),按下式計(jì)算,在該放大系統(tǒng)下目微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度:例如:目微尺是100格,其對(duì)應(yīng)的物微尺是80格,則目微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度為80/100×10=8m。測(cè)量某一
4、細(xì)胞時(shí),如果目微尺測(cè)得其橫徑為5格,則此細(xì)胞橫徑為8×5=40m。五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容(一)實(shí)驗(yàn)器材1、器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、剪刀、恒溫水浴箱、小培養(yǎng)皿、吸管、牙簽、燒杯、吸水紙、擦鏡紙等2、試劑 0.9%生理鹽水、0.1%亞甲基蘭、1% 碘液、蒸餾水、無(wú)水乙醇等3、材料 真核、原核細(xì)胞涂片或切片,動(dòng)、植物不同組織的新鮮材料切片。4、溶液或試劑:香柏油,二甲苯。(二)操作步驟(一)、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察:1、涂片法:人口腔上皮細(xì)胞的觀察:1)在潔凈的載玻片中央,滴一滴生理鹽水。2)用消毒牙簽的一端,在漱凈的口腔側(cè)壁上輕輕地刮幾下。3)把牙簽上附有碎屑的一端,放在載玻片上的生理鹽水
5、滴中涂勻。4)用鑷子夾起潔凈的蓋玻片,將它的一邊先接觸載玻片上的生理鹽水滴,然后,輕輕地蓋在水滴上。然后在蓋片的一側(cè)加一滴0.1%亞甲基蘭染液,在蓋片的另一側(cè)用吸水紙吸取,染色后細(xì)胞核被染成深藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)淺藍(lán)色。5)用顯微鏡觀察細(xì)胞形狀,細(xì)胞呈扁平鱗狀。2、撕片法:撕一小片植物表皮(洋蔥、芹菜和韭菜),放在盛有一小滴蒸餾水的載玻片上,用鑷子展平,蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察。細(xì)胞大小和形狀如何?(二)細(xì)胞大小的測(cè)定:1、將目微尺放于目鏡內(nèi)。2、將物微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上。3、小心轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺,移動(dòng)物微尺使兩尺平行,起點(diǎn)線重合,然后找出另一處兩尺刻度重合處。4、記錄起點(diǎn)線到重合線之間的各尺的刻度
6、數(shù)(格數(shù)),按下式計(jì)算,在該放大系統(tǒng)下目微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度:目微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度 = 物微尺格數(shù)/目微尺格數(shù) × 10M5、將制作的各種細(xì)胞臨時(shí)裝片置于載物臺(tái)上,測(cè)定細(xì)胞的大?。òㄩL(zhǎng)徑和短徑)。 六、注意事項(xiàng):1、制作臨時(shí)裝片時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。2、用物微尺標(biāo)定的目微尺每格長(zhǎng)度的數(shù)值代表在某一放大系統(tǒng)下的情況,這一數(shù)值會(huì)隨物鏡的放大率而改變,因此,在什么放大倍數(shù)物鏡下標(biāo)定的目微尺只能在同一放大倍數(shù)的物鏡下測(cè)定細(xì)胞的大小。實(shí)驗(yàn)二 細(xì)胞和細(xì)胞器活體染色一、實(shí)驗(yàn)類型綜合性實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布; 2、學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活
7、染色技術(shù)。三、預(yù)習(xí)要求 預(yù)習(xí)各種細(xì)胞及其細(xì)胞器染色原理和方法。四、實(shí)驗(yàn)原理 活體染色是能使生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織特異性著色但對(duì)活樣品又沒(méi)有毒害作用的一種活體染色方法,其目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu),而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡?;铙w染色技術(shù)可用來(lái)研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。通常把活體染色分為體內(nèi)活體染色與體外活體染色兩類。體外活體染色又稱超活染色,它是由活的動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊,以染料溶液浸染,染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?;铙w染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分,主要是靠染料的“電化學(xué)”特性。堿性染料的膠
8、粒表面帶陽(yáng)離子,酸性染料的膠粒表面帶有陰離子,而被染的部分本身也是具有陰離子或陽(yáng)離子,這樣,它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活體染色,理論上應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性或毒性極小的染料,且使用時(shí)需要配成稀淡的溶液。一般說(shuō)來(lái),最為適用的是堿性染料,這可能是因?yàn)樗哂腥芙庠陬愔|(zhì)(如卵磷脂、膽固醇等)的特性,易于被細(xì)胞吸收。詹納斯綠B(Janus green B)和中性紅(neutral red)兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料,對(duì)于線粒體和液泡系的染色分別具有專一性。 線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要細(xì)胞器,是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所。細(xì)胞的各項(xiàng)活動(dòng)所需要的能量,主要是通過(guò)線粒體呼吸作用
9、來(lái)提供的?;铙w染色是應(yīng)用無(wú)毒或毒性較小的染色劑真實(shí)地顯示活細(xì)胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而又很少影響細(xì)胞生命活動(dòng)的一種染色方法。詹納斯綠 B是線垃體的專一性活體染色劑。線粒體中細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))呈藍(lán)綠色,而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原,成為無(wú)色狀態(tài)。中性紅為弱堿性染料,對(duì)液泡系(即高爾基體)的染色有專一性,只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色,細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色,這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。 五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容(一)實(shí)驗(yàn)器材1、器材 顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、解剖盤載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙等2、試劑 Wright 溶液、甲醇60ml、
10、蘇木精、硝酸銀、中性紅-詹納斯綠染液等(1)Ringer溶液: 氯化鈉 8.5g (變溫動(dòng)物用6.5g) 氯化鉀 2.5g 氯化鈣 0.3g 蒸餾水 1000ml (2)1%、1/3000中性紅溶液: 稱取0.5g中性紅溶于50ml Ringer液,稍加熱 (3040)使之很快溶解,用濾紙過(guò)濾,裝入棕色瓶于暗處保存,否則易氧化沉淀,失去染色能力。臨用前,取已配制的1%中性紅溶液1ml,加入29ml Ringer溶液混勻,裝入棕色瓶備用。(3) 1%、1/5000詹納斯綠B溶液 稱取50mg詹納斯綠B溶于5ml Ringer溶液中,稍加微熱(3040),使之溶解,用濾紙過(guò)濾后,即為1%原液。取1
11、%原液l ml加入49ml Ringer溶液,即成1/5000工作液裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配,以保持它的充分氧化能力。 3、材料 真核、原核細(xì)胞涂片或切片,動(dòng)、植物不同組織的新鮮材料切片。4、溶液或試劑:香柏油,二甲苯。(二)操作步驟1. 人口腔上皮細(xì)胞線粒體的活體染色及觀察實(shí) 驗(yàn) 方 法1、人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察清潔載玻片放在37恒溫水浴鍋的金屬板上 滴2滴1/5000詹納斯綠B染液 用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞 刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中 染色10l5min(注意不可使染液干燥,必要時(shí)可再加滴染液) 蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察 2、植物細(xì)胞液泡系的超活染色
12、與觀察 取豆芽的根尖 用刀片縱切根尖 放入中性紅染液滴中,染色510min。 吸去染液,滴一滴Ringer液 蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢(鑷子輕輕地下壓蓋玻片,使根尖壓扁,利于觀察) 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 在高倍鏡下,先觀察根尖部分的生長(zhǎng)點(diǎn)的細(xì)胞,可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡,這是初生的幼小液泡。然后,由生長(zhǎng)點(diǎn)向延長(zhǎng)區(qū)觀察,在一些已分化長(zhǎng)大的細(xì)胞內(nèi),液泡的染色較淺,體積增大,數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中,一般只有一個(gè)淡紅色的巨大液泡,占據(jù)細(xì)胞的絕大部分,將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。實(shí)驗(yàn)報(bào)告(1)描述口腔上皮細(xì)胞示線粒體的形態(tài)與分布 (2)細(xì)胞中液泡形態(tài)與分布實(shí)驗(yàn)三 酸性磷酸酶(AC
13、P)的顯示方法一、實(shí)驗(yàn)類型驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖寣W(xué)生熟悉并掌握細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶的顯示方法和原理;了解植物液泡在化學(xué)組成上的特點(diǎn)。掌握顯示細(xì)胞中ACP的操作步驟,觀察酸性磷酸酶在細(xì)胞內(nèi)的分布狀況。三、預(yù)習(xí)要求 預(yù)習(xí)組織細(xì)胞制片及染色的過(guò)程;理解細(xì)胞吞噬作用、溶酶體功能和分布以及溶酶體標(biāo)志酶的性質(zhì)。四、實(shí)驗(yàn)原理酸性磷酸酶廣泛存在于各種動(dòng)物植物組織細(xì)胞的溶酶體中,當(dāng)溶酶體膜保持穩(wěn)定和完整時(shí),底物不易滲入溶酶體中,溶酶體內(nèi)的酸性磷酸酶活力微弱或無(wú)活性。酸性磷酸酶在組織退變過(guò)程中活性增強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞被固定,并在合適的pH值下,溶酶體膜的通透性被改變而變得不穩(wěn)定,其底物滲透入溶酶體中,酸性磷酸酶顯現(xiàn)活力。故
14、其在研究溶酶體異常時(shí)有意義。酸性磷酸酶分解磷酸脂而釋放出磷酸基。在PH5.0的環(huán)境中,磷酸基與鉛鹽反應(yīng)形成磷酸鉛。但磷酸鉛是無(wú)色的,所以再與硫化銨作用,形成棕黑色的硫化鉛沉淀,由此就能顯示酸性磷酸酶在細(xì)胞內(nèi)的存在與分布。本實(shí)驗(yàn)的技術(shù)特點(diǎn)是:用較短的作用時(shí)間,可避免細(xì)胞質(zhì) 內(nèi)其它蛋白質(zhì)及核內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性假象,保證了實(shí)驗(yàn)的可靠性。Gomori硝酸鉛改良法是根據(jù):以磷酸酯為底物,其被磷酸酶水解后釋放出磷酸基,在 pH5左右和鉛鹽結(jié)合成磷酸鉛鹽,但磷酸鉛無(wú)色,須經(jīng)硫化銨作用使其變成棕黃色至棕黑色的硫化鉛沉淀。五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容(一)試劑與器材1.材料:洋蔥。2.試劑: Gomori硝酸鉛作用液、1硫化銨溶液等。
15、1) 10%中性福爾馬林(pH6.87.2) 甲醛 10ml 醋酸鈉
16、0; 2g 蒸餾水 90ml 2)酸性磷酸酶作用液 蒸餾水
17、60; 90ml 0.2mol/L 醋酸緩沖液(pH4.6) 12ml 5%硝酸鉛
18、60; 2ml 3.2%-甘油磷酸鈉 4ml 先將蒸餾水和醋酸緩沖液混合,隨后分成大致相等的兩份,一份中加醋酸鉛溶液,另份加甘油磷酸鈉溶液,然后
19、再將兩者緩緩混合,邊混勻邊攪勻。若PH5.0,可加少量醋酸調(diào)節(jié)。臨用前配制。配好后的作用液應(yīng)透明無(wú)絮狀懸浮物和沉淀,否則將嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 3) 1%硫胺溶液 硫化胺 1ml 蒸溜水
20、; 9ml 4) 姬姆薩染液(1:30) 姬姆薩原液
21、; 3 滴 磷酸鹽緩沖液(PH6.8) 5ml 3.器材:冰箱,顯微鏡、注射器、解剖用具、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片,內(nèi)有濕紗布的小鋁盒等。(二)操作步驟。 1.取洋蔥內(nèi)表皮
22、(1cm×0.6cm每瓶放3片)沉于10%中性富爾馬林液中,4下固定30分鐘,(置冰箱貯藏室),對(duì)照實(shí)驗(yàn)置50烘箱中。(加液至青霉素瓶1/2體積)2.去福爾馬林液,自來(lái)水漂洗5分鐘。(青霉素瓶水加滿,換3次)3.去水,加酸性磷酶作用液,室溫下置30分鐘。(加液至青霉素瓶1/3體積)4.去作用液,自來(lái)水漂洗10分鐘。(青霉素瓶水加滿,換3次)5.去水,加1%硫化銨處理3-5分鐘。(加液至青霉素瓶1/3體積)6.去硫化銨,加水漂洗。(青霉素瓶水加滿,換1次)7.置載玻片上,加蓋玻片。8.顯微鏡觀察(注意液泡中標(biāo)黑色的小顆粒,表示有酸性磷酸酶的活力)。9.顯微數(shù)碼拍照。六、注意事項(xiàng)作對(duì)照實(shí)
23、驗(yàn):在處理過(guò)程中,對(duì)照組的作用液中不加入甘油磷酸鈉而加入蒸餾水,則呈陰性。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞膜的滲透性一、實(shí)驗(yàn)類型驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解細(xì)胞膜對(duì)物質(zhì)通透性的一般規(guī)律。2.了解溶血現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制。3掌握普通光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞及細(xì)胞碎片的形態(tài)。三、預(yù)習(xí)要求 預(yù)習(xí)細(xì)胞膜的組成及功能特點(diǎn)。四、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的選擇通透性屏障。它是一種半透膜,可選擇性控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。將紅細(xì)胞放在低滲鹽溶液中,水分子大量滲到細(xì)胞內(nèi),可使細(xì)胞 脹破,血紅蛋白釋放到介質(zhì)中,由不透明的紅細(xì)胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液,這種現(xiàn)象稱為溶血。將紅細(xì)胞放在某些等滲鹽溶液中,由于紅細(xì)胞膜對(duì)各種溶
24、 質(zhì)的通透性不同,膜兩側(cè)的滲透壓平衡會(huì)發(fā)生改變,也會(huì)發(fā)生溶血現(xiàn)象。因此,發(fā)生溶血現(xiàn)象所需時(shí)間長(zhǎng)短可作為測(cè)量物質(zhì)進(jìn)入紅細(xì)胞速度的一種指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選用紅細(xì)胞作為細(xì)胞膜透性的實(shí)驗(yàn)材料,將其放入不同的介質(zhì)溶液中,觀察紅細(xì)胞的變化。五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容(一)試劑與器材1.材料:血細(xì)胞。2.器材:普通顯微鏡、試管、試管架、滴管、載玻片、蓋玻片、擦鏡紙、記號(hào)筆等。3. 試劑:0.128 mol/L NaCl溶液、0.128 mol/L NH4Cl溶液、0.128 mol/L 醋酸銨溶液、0.128 mol/L草酸銨溶液、 0.128 mol/L NaNO3溶液、0.24mol/L 葡萄糖、0.24mol/L甘油、
25、0.24mol/L 乙醇、 0.24mol/L 丙酮、蒸餾水。(1)Alsever溶液葡萄糖 2.05g 檸檬酸鈉(Na9C6H5O7.2H2O) 0.89g 檸檬酸(C6H6O7.H2O) 0.05g 氯化鈉 0.42g 蒸餾水 100ml 調(diào) PH 至 7.2,過(guò)濾滅菌或高壓滅菌 10min,置 4冰箱保存。(二)操作步驟1血細(xì)胞懸液的制備:取從集市處接新鮮血5ml(防止污染),放入盛有20ml Alsever溶液瓶中,勻后置冰箱保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)使用)。 2.使用前,取用 Alsevers 液保存的新鮮雞血 5ml,加入 8ml 0.128mol/L 的 NaCl 溶液,小心混勻,1000
26、 rmin離心 5min,如此 3 次洗滌,最后成 30%的雞紅細(xì)胞(CRBC)懸液。3.取 10 支試管,按附表中所示測(cè)試溶液,分別取樣各 3ml,作出標(biāo)記后,各管均加入紅細(xì)胞懸液 2 滴,混勻后靜置于溫室中,觀察各支試管中發(fā)生溶血的時(shí)間及其變化。4.顯微鏡檢查細(xì)胞的完整性5.結(jié)果1)試管內(nèi)液體分兩層:上層淺黃色透明,下層紅色不透明為不溶血;鏡檢紅細(xì)胞完好為不溶血。2)如果試管內(nèi)液體混濁,上層帶紅色者,稱不完全溶血(或)鏡檢有部分紅細(xì)胞呈碎片。3)如果試管內(nèi)液體變紅而透明者,稱完全溶血(),鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部呈碎片。六、注意事項(xiàng)1.膠頭滴管不可混用,以免造成溶液間的交叉污染。2. 雞血在離心時(shí),試管均需在扭力天平上平衡。離心結(jié)束后,小心傾去上層血漿及中層血小板等成分,盡量控干。目測(cè)紅細(xì)胞體積或置于帶刻度的離心管中,加入生理鹽水配成30%的紅細(xì)胞懸液;試管中有紅細(xì)胞和測(cè)試溶液時(shí),不應(yīng)強(qiáng)力搖晃,以免造成人為的紅細(xì)胞破裂。3. 結(jié)論應(yīng)肉眼觀察與鏡檢相結(jié)合。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告,并就細(xì)胞膜對(duì)不同物質(zhì)的滲透性不同,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,見(jiàn)表 1。 表 1 各種溶液的溶血現(xiàn)象觀察結(jié)果編號(hào)測(cè)試溶液是否溶血分析原因1
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