Livin基因在非小細胞肺癌中表達的分子生物學特性

1、Livin基因在非小細胞肺癌中表達的分子生物學特性    【關鍵詞】  Livin基因; 非小細胞肺癌; 分子生物學 原癌基因和抑癌基因所編碼的蛋白存在于細胞的各個組成部分中，包括細胞核、細胞質、線粒體和細胞膜。通過對原癌和抑癌基因蛋白結構和功能的分析，發(fā)現許多原癌基因和抑癌基因位于信號通路中的不同部位，參與許多重要的細胞活動過程，如細胞生長和分化、DNA復制和損傷修復、基因轉錄和表達、細胞周期調控等，在細胞凋亡、衰老過程當中起重要作用，也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉移中扮演重要角色。Livin蛋白是新近發(fā)現的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of

2、 apoptosis protein，IAP)家族的新成員之一，具有抗細胞凋亡作用，并明顯地在腫瘤組織中特異性表達。目前的研究表明， Livin基因在各系統(tǒng)的正常組織中很少表達，但在胚胎組織或發(fā)育組織、淋巴細胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多種組織中廣泛表達。非小細胞肺癌（non?small?cell lung cancer，NSCLC）的腫瘤細胞系中也有Livin基因的表達，但其與腫瘤的發(fā)生、轉移、耐藥性等之間的確切關系尚不清楚。Livin基因特異性地表達于腫瘤組織，有可能成為NSCLC早期診斷的分子標志物，并為基因治療提供新靶點1-3。本文就Livin基因在NSCLC中的表達及

3、其抗細胞凋亡作用、信號傳導途徑與調節(jié)機制等分子生物學特性作一綜述。     1  Livin基因及蛋白結構功能的多樣性     IAP是一類重要的抗細胞凋亡因子，其共同的結構特征是N端含有一個或多個(最多為3個)串聯的桿狀病毒IAP重復序列結構域(baculovirus IAP repeats domain，BIRs)和C端含有一個環(huán)指結構域(RING finger domain，RING)。目前已發(fā)現人類IAP家族有8個成員，即NIAP,XIAP(ILP1/MIHA)，cIAP1(HIAP2/MIHB)

4、，cIAP2(HIAP1/MIHC)，survivin(TIAP)，apollon(Bruce)，ILP2(TsIAP) 和livin(ML?IAP/KIAP)2。     Livin蛋白是IAP家族的一個新成員，一些實驗室采用IAP同源序列(BIR或RING)尋找的方法，分別從人類基因組cDNA文庫中克隆得到Livin核苷酸序列，從不同的組織中發(fā)現了Livin基因的表達。Kasof等3在發(fā)育組織和腫瘤組織中發(fā)現并命名了Livin基因。Lin等4從人胎腎cDNA文庫中分離到該基因，故稱其為KIAP（kidney inhibitor of apoptosi

5、s protein，KIAP）。Vucic等5發(fā)現Livin基因在G361 和 SK?Mel29兩種黑色素瘤細胞源株中高表達，將其命名為MLIAP（melanoma inhibitor of apoptosis protein）。Ashhab等6發(fā)現了該基因存在2個剪接變異體（isoforms），分別命名為Livin 和Livin 。 同時，Lin等4用熒光原位雜交方法確定Livin基因位于人20號染色體20q13.3區(qū)域，全長4.6 kb，包含7個外顯子。此外還發(fā)現存在長約2.2,2.8和4.0 kb的轉錄子，Livin蛋白N端僅包含一個BIR結構，包含4個螺旋和一個三股抗平行 片層，與相應

6、的氨基酸殘基共同構成疏水核心。C端含有一個RING環(huán)指結構4,6，氨基酸殘基C124,C127,H44及C151與鋅原子結合，借以穩(wěn)定整個重疊結構。         Livin蛋白有和兩種變異體，分別由298和280個氨基酸組成，二者相差18個氨基酸，此區(qū)域由介于BIR和RING結構之間的第6外顯子5端54 bp的基因序列編碼。Livin蛋白主要表達于胞質，但Kasof等3認為livin蛋白的細胞內分布與Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞質內呈絲狀表達，同時也表達于胞核，并認為livin蛋白 C末端的R

7、ING結構對介導其在亞細胞水平上的分布具有重要作用。Livin基因mRNA 3端非翻譯區(qū)多腺苷酸化與存在未剪接加工成熟的前體RNA有關，不同的剪輯有不同的變異體及亞型，這種結構基礎有可能解釋Livin基因蛋白存在多個結構功能。如BIR結構域內單個氨基酸的突變就能發(fā)揮其抗凋亡作用，作者的實驗也發(fā)現在A549細胞中表達的Livin 蛋白缺少66個核苷酸的變異體，其確切的功能意義尚不清楚。但Livin基因蛋白結構的變化與其功能的多樣性存在明顯的相關性。     2  Livin基因在NSCLC中的表達    

8、Livin基因僅在少數正常組織中表達，各家報道的研究結果存在較大差異，目前還不能確定Livin基因在人正常組織中的表達譜及其生理意義2,7。Tanabe等7采用 RT?PCR法對15例正常肺組織和38例NSCLC組織作對比研究，發(fā)現Livin mRNA在NSCLC組織陽性率為73.6%，正常肺組織陽性率為6.7%，顯示Livin基因在NSCLC中呈高表達，同時證明Livin基因與Survivin基因在NSCLC中的表達并不相關。Crnkovic?Mertens 等1,8同時采用NSCLC組織和NSCLC源 HeLa細胞株培養(yǎng)檢測Livin基因及其兩種異構體Livin 和Livin 的表達，結果

9、顯示Livin 和Livin 在NSCLC中呈高表達。采用RNAi技術分別使異構體基因沉默，發(fā)現Livin 和Livin 基因的功能意義不完全相同， Livin 在細胞凋亡中起關鍵作用。國內崔肅等9采用RT?PCR法檢測NSCLC組織中Livin mRNA和Livin  mRNA的表達，并用Western blot方法分析Livin蛋白的表達，結果顯示45例NSCLC組織中Livin mRNA表達陽性率為71.1，兩種異構體基本同時表達，Livin mRNA的表達量略高于Livin mRNA。而在癌旁正常肺組織和肺良性瘤樣病變組織呈低表達，陽性率分別為5.7和6.7。而且Livin

10、mRNA表達陽性標本中均能檢測到Livin蛋白表達。陳淼等10采用免疫組織化學(SABC)的方法檢測Livin蛋白在40例NSCLC組織以及12例正常和肺良性疾病組織中的表達，結果顯示22例腺癌和18例鱗癌組織中的Livin蛋白陽性率分別為45.5?和50.0?，而正常肺組織和肺良性疾病組織均未檢出Livin蛋白表達。他們同時觀察到不同分化程度NSCLC組織之間Livin蛋白的表達無顯著性差異。有和無淋巴結轉移的肺癌組織中Livin蛋白表達的陽性率分別為72.7?和11.1?,兩組的顯著性差異標志著不同的生物學特性。孫建國等11 的研究結果顯示，48例NSCLC組織中Livin mRNA表達陽

11、性率為22.9%，其表達與NSCLC組織學類型相關，腺癌中Livin mRNA表達陽性率達45.5%，明顯高于鱗癌和大細胞癌，而癌旁組織和肺良性疾病組織均未檢出陽性結果，而且Livin 蛋白表達與mRNA表達相一致。研究還發(fā)現放、化療后NSCLC組織中的Livin表達的陽性率為43.5%，顯著高于未放、化療組織，提示放、化療可明顯誘導Livin蛋白的表達，這可能與臨床上NSCLC對化療藥物和放療耐受有關。         目前，Livin基因在NSCLC組織中特異性地高表達的現象已引起許多學者的關注1，但Livin

12、 mRNA的表達與NSCLC患者的病理分型、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM分期等的相關關系尚未完全闡明，Livin基因作為NSCLC的分子標志物，成為診斷和治療NSCLC新靶點的可能性已引起人們的極大興趣。     3  Livin抗細胞凋亡作用及其調節(jié)機制     Kasof等3,8研究顯示，Livin蛋白N端的羧基與Caspase?3,7,9的直接結合，阻斷了caspase發(fā)揮凋亡作用的途徑，從而抑制了細胞凋亡的發(fā)生。將Livin基因轉染HeLa細胞，受轉染細胞內由FADD（Fasassociate

13、d protein with death domain）,Bax,RIP,RIP3及DR6誘導的細胞凋亡可被有效阻斷。Vucic等13將Livin基因轉染乳腺癌MCF7細胞，證實轉染細胞對Fas,TNFR?1（tumor necrosis factor receptor? 1）,DR4（death receptor 4）及DR5介導的細胞凋亡具有顯著的抑制作用。許多化療藥物可導致腫瘤細胞DNA的損傷而誘導細胞凋亡，轉染Livin基因的MCF7細胞可有效對抗阿霉素以及4TBP（4 tertiary butylphenol）誘導的細胞凋亡。但是各家報道Livin 和Livin 蛋白的抗細胞凋亡作用

14、存在一定差異。Yang等14,15觀察在Jurkat T淋巴細胞株中，Livin基因可明顯抑制由TNF及抗CD95抗體誘導的細胞凋亡，其抗細胞凋亡作用強于Bcl 2。Livin 對STS誘導的Jurkat細胞凋亡表現出一定的抑制作用，而Livin 則無此作用。Crnkovic?Mertens 等8 采用RNA干擾技術分別使內源性Livin 和Livin 基因沉默，檢測兩者的抗凋亡作用，結果顯示Livin 可顯著抑制依托泊苷（etoposide）和紫外線放射治療（UV irradiation）等誘導的HeLa細胞凋亡，但Livin 則不明顯。更多的研究則認為Livin 和Livin 基因均具有抗

15、細胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途徑有待進一步證實。     許多研究證實12-16，Livin蛋白介導細胞凋亡抑制存在不同的調節(jié)途徑，通過與激活形式的Caspase 3和Caspase 7結合，抑制其活性。Livin蛋白還可與未加工的或斷裂形式的Caspase 9結合，可抑制由Apaf 1（apoptosis protein activating  factor 1）、細胞色素C及dATP誘導的Caspase 9激活作用。 Livin蛋白與Caspase的結合抑制作用具有高度的特異性和親和性，BIR結構域內單個氨基酸的突變即可導致Livi

16、n蛋白與Caspase的結合作用的減弱或消失，致使Livin蛋白抗細胞凋亡作用的明顯降低甚至完全喪失，這也許可成為基因治療的調節(jié)點。Sanna 等12的研究顯示，Livin可激活MAP（mitogen activated protein）激酶JNK1和JNK2，但對JNK3無激活作用，而Livin蛋白對JNK1的激活作用遠遠強于JNK2，并且這是Livin蛋白對抗TNF和ICE介導的細胞凋亡作用的重要途徑之一。 JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin蛋白對JNK1的激活并不依賴于MKK4/MKK7信號途徑，而是通過TAB1/TAK1途徑實現。 TAK1是MAP3激酶之一，在

17、TGF1的刺激下TAK1可激活JNK1。 TAB1是TAK1的共活化因子（coactivator），TAB1本身對于JNK1無激活作用，但可促進TAK1介導的JNK1激活作用。Livin蛋白可與TAB1結合，并進一步激活TAK1。此外，Vucic 等13證實SMAC（ second mitochondrial activator of caspases, SMAC）及活性肽片段可與Livin蛋白的BIR結構域特異性結合，抑制Livin蛋白與caspase的結合及其抗細胞凋亡作用。因此存在著由SMAC介導的對Livin蛋白抗細胞凋亡作用的負性調節(jié)機制。   

18、0;     4  Livin基因治療NSCLC的臨床應用前景     鑒于Livin基因具有明顯的抗細胞凋亡作用以及在腫瘤組織中的特異性表達，人們注意到其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系，并開始探討Livin用于腫瘤基因治療的可行性。應用基因轉染技術可獲得穩(wěn)定表達Livin 和Livin 的NSCLC A549細胞克隆。孫建國等17用平板克隆形成實驗研究A549細胞生長情況，用MTT法檢測其對放、化療的敏感性，用細胞周期分析法觀察細胞凋亡情況。結果發(fā)現轉染Livin 和Livin 基因后的細胞尤其是表達Livin

19、的A549細胞，克隆形成能力提高、倍增時間縮短，對多種化療藥物和放射線敏感性降低，10 Gy放射線照射下僅有0.2%細胞發(fā)生凋亡?？梢?Livin基因參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，也可能是NSCLC細胞對放、化療耐受的重要機制之一。      Crnkovic?Mertens等18利用基因轉染和特異性小干擾RNA(siRNA)技術，在肺癌SPC?A1細胞株中建立Livin異構體和特異的基因沉默體系，觀察誘導SPC?A1細胞凋亡效應中的不同作用，并用TUNEL法和流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果顯示內源性Livin 和Livin 基因沉默后，SPC?A1細胞克隆

20、形成能力較對照組顯著下降，促使SPC?A1細胞發(fā)生凋亡，表明Livin 和Livin 兩種異構體均能作為誘導肺癌細胞凋亡的分子靶點，通過使Livin基因沉默的靶向誘導肺癌細胞凋亡可作為手術、化療、放療等傳統(tǒng)治療的輔助手段。     由于Livin基因僅在腫瘤組織表達而在正常組織極少表達，Yagihashi等19用ELISA法在肺癌患者外周血和腫瘤組織中均檢測到自身Livin蛋白抗體，其組織特異性顯而易見。Hariu等20  用Livin反義核苷酸片段刺激周圍淋巴細胞，發(fā)現HLA?A24與Livin 7肽具有特殊親和力，Livin蛋白表達陽性的N

21、SCLC患者可檢測到特異性細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs），而Livin蛋白表達陰性NSCLC患者則測不到CTLs。結果提示Livin蛋白可成為NSCLC免疫治療的靶點，將Livin 7肽作為免疫制劑具有良好的應用前景。綜上所述，Livin基因是腫瘤細胞凋亡途徑中的一個信號調節(jié)點，其在NSCLC組織中的特異性表達為NSCLC的診斷提供了新的分子標記物，亦可成為NSCLC治療的新靶點21，22。目前，人們已能在基因水平上干預因基因表達異常而導致的疾病，尤其是以mRNA為靶標的反義藥物，可抑制和消除致病基因的表達，達到治療的目點。因此，采用反義核苷酸（a

22、ntisense oligonucleotides）、小分子抑制劑（small?molecule inhibitors）和免疫介入（immune?mediated approaches）等基因治療手段直接阻斷Livin 蛋白與目的分子的結合，可以促使腫瘤細胞的凋亡，為NSCLC的治療開辟新的途徑23，24。同時，對NSCLC患者腫瘤組織和外周血免疫細胞的Livin蛋白（受體）及其mRNA表達的聯合檢測，有可能成為NSCLC早期診斷、轉移風險和預后的分子標記物。      【參考文獻】  1 Crnkovic?Mertens I, Mu

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