2019白藜蘆醇對肝癌Bel

1、白藜蘆醇對肝癌Bel擬7404細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響（作者：單位：郵編：）【摘要】 目的研究白藜蘆醇對肝癌Bel擬7404細(xì)胞增殖、凋亡及侵 襲的影響。方法MTT法和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA測定法檢測白藜蘆醇 對Bel擬7404細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)和TdT酶介導(dǎo)的dUTP缺 口末端標(biāo)記法檢測白藜蘆醇對 Bel擬7404細(xì)胞凋亡的影響；黏附實 驗、運動實驗和侵襲實驗檢測白藜蘆醇對Bel擬.7404細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果白藜蘆醇濃度25卩mol/L可抑制肝癌細(xì)胞Bel擬7404 增殖,并誘導(dǎo)凋亡（P0.01）;濃度100卩mol/L正常肝細(xì)胞L02的增殖 也受到抑制，并產(chǎn)生凋亡（P0.

2、01）。25,50卩mol/L的白藜蘆醇可抑制 Bel擬7404細(xì)胞黏附細(xì)胞外基質(zhì)纖連蛋白（FN）及降解基質(zhì)的能力 （P0.01）,對該細(xì)胞的運動能力無明顯抑制作用。結(jié)論一定濃度的白藜蘆醇可抑制肝癌Bel擬7404細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并可能通過抑制 Bel擬7404細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)FN的黏附及對基質(zhì)的降解來抑制 Bel 擬7404細(xì)胞的侵襲能力；在較高濃度下（ 100卩mol/L）,白藜蘆醇 對正常肝細(xì)胞株也產(chǎn)生抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的毒性作用?！娟P(guān)鍵詞】藜蘆生物堿類癌肝細(xì)胞肝腫瘤細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡 腫瘤侵潤自從葡萄酒中發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇以來，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)它具有保護心 肌細(xì)胞、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集

3、、抗內(nèi)毒素休克、降血脂、抗 脂質(zhì)過氧化、鎮(zhèn)咳、平喘、抗病原微生物及抗老年癡呆等眾多生理功 能。近年來又發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗腫瘤功能，表現(xiàn)為對某些腫瘤的起 始、促進、進展3個階段均有抑制作用1。白藜蘆醇并非對所有腫 瘤都有抑制作用，而且其抗腫瘤機制目前尚不明確。肝癌為我國最常 見的惡性腫瘤之一，是重要的抗腫瘤研究對象。筆者從腫瘤細(xì)胞增殖、 凋亡及侵襲方面探討白藜蘆醇的抗肝癌細(xì)胞株機制，以及對正常肝細(xì) 胞的毒性作用。1材料與方法1.1材料肝癌細(xì)胞Bel擬7404及正常肝細(xì)胞L02均由福建省肝膽外 科研究所提供；白藜蘆醇由福建師范大學(xué)生物工程學(xué)院提純生產(chǎn)（純 度約99.8%）;RPMI 1640和DM

4、EM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）;噻唑藍(lán) （thiazolylblue,MTT）、胰蛋白酶（北京華美生物科技有限公司）;PCNA 試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）;TUNEL試劑盒（美國Premega公司）;Transwell 小室（美國Corning公司）;纖連蛋白（FN） 和基底膜基質(zhì)凝膠Matrigel（美國BD公司）。1.2細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞 Bel擬7404在含10%、牛血清的RPMI 1640 中、L02在含10%、牛血清的DMEM中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%融和 時,取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。實驗均分為2組;對照組不加 白藜蘆醇,處理組中加入不同濃度的白藜蘆醇。1.3細(xì)

5、胞增殖測定（1）用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞消化制成 2X 105 mL 擬1單細(xì)胞懸液，按每孔100卩L接種于96孔板,處理組白藜蘆醇終 濃度分別為 12.5,25,50,100,200卩 mol/L,分別在 12,24,48 h 各取 1塊板,換不含血清的培養(yǎng)液每孔100卩L,各孔中加 MTT 10卩L（5mg/mL），孵育 4 h,加入 MTT裂解液（10%SDS,5異丁醇,0.012 mmol/L HCL）100卩L,37 C孵育18 h后，酶標(biāo)儀（Bio擬Rad 550型，美國Bio 擬Rad公司）測取D（550 nm）的光密度值，取4孔平均值。該值反映活 細(xì)胞數(shù)目，即細(xì)胞增殖程度。（

6、2）制備2X 105 mL擬1單細(xì)胞懸液，接 種于置于6孔板中的玻片上，處理組白藜蘆醇終濃度分別為 12.5,25,50,100,200 卩mol/L。選擇48 h作為終止時間,按試劑盒說 明書進行。以已知PCNA陽性的乳腺癌細(xì)胞作為陽性對照，以PBS代替 一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察，計算PCNA標(biāo)記指數(shù)，即計數(shù)1 000 個腫瘤細(xì)胞中PCNA陽性細(xì)胞的百分率。1.4細(xì)胞凋亡測定（1）細(xì)胞經(jīng)過同步化后，即無血清培養(yǎng)24 h,再加入 10%血清及不同濃度白藜蘆醇（12.5,25,50,100,200 卩mol/L）培養(yǎng)48 h。收集懸浮細(xì)胞及貼壁細(xì)胞，經(jīng)2 000 r/min 離心5 min

7、,沉淀重懸 于PBS 1 mL,400目篩網(wǎng)過濾，取細(xì)胞懸（COULTER EPICS XI型,美國 Beckman Coulter公司）488 nm激發(fā),605 nm檢測，每次檢測104個細(xì) 胞。用MultyCycle軟件進行DNA含量和細(xì)胞凋亡率分析，DNA含量低 于G1期二倍體DNA勺細(xì)胞為亞二倍體細(xì)胞。（2）按PCNA僉測方法接 種細(xì)胞，選擇3個濃度白藜蘆醇（25,50,100卩mol/L）作用細(xì)胞48 h。 按TUNE試劑盒說明書進行，以DNasel處理腫瘤細(xì)胞作為陽性對照。 顯微鏡下隨機計數(shù)200個細(xì)胞,計算陽性細(xì)胞比率。1.5細(xì)胞侵襲檢測1.5.1 細(xì)胞黏附試驗（MTT法）取96

8、孔培養(yǎng)板，每孔加入FN 20卩 L（100 mg/L）,風(fēng)干后置4 C備用，用PBS洗 2次重新水化。2X 105 mL 擬1濃度的Bel擬7404細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔100卩 L,處理組白藜蘆醇終濃度分別為12.5,25,50卩mol/L,每組復(fù)3孔。 置37 C、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，分別于30,60,90 min 后，棄去上清液,PBS沖洗2次除去未黏附細(xì)胞。黏附細(xì)胞用 MTT法在 酶標(biāo)儀上測定D（550 nm）值,并計算黏附抑制率：黏附抑制率=（對照組黏附細(xì)胞D值擬處理組黏附細(xì)胞D值）/對照組 黏附細(xì)胞D值1.5.2細(xì)胞運動實驗在Tran swell小室濾

9、膜的下室面鋪上FN 10卩 L（0.2 mg/mL）,超凈工作臺中風(fēng)干備用。取 1X 106 mL-1 BeI擬7404 細(xì)胞懸液（培養(yǎng)基為0.1% BSA的RPMI 1640）,處理組Transwell小室 的上室中加入白藜蘆醇（終濃度分別為12.5,25,50卩mol/L的細(xì)胞 懸液100卩L）,下室分別加入用上述培養(yǎng)基制成白藜蘆醇溶液600卩L,終濃度與上室相同，各組均復(fù)3孔。37 C、體積分?jǐn)?shù)為0.05的 CO2中培養(yǎng)12 h后取出濾膜，甲醇固定,棉簽拭去上室面的細(xì)胞，常規(guī) 蘇木精擬伊紅（H擬E）染色。隨機于顯微鏡下取上、下、左、右、中 心5個視野,計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。以該細(xì)胞數(shù)目表示腫瘤

10、細(xì)胞的運動能 力。1.5.3體外侵襲實驗使用運動實驗中的 Tran swell小室,濾膜的下室 面鋪上FN并風(fēng)干后，在小室上室面均勻鋪上1 : 3 RPMI 1640稀釋的 Matrigel,置37 C培養(yǎng)箱30 min使之凝固，其他步驟同1.5.2，以計 數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目來反映腫瘤細(xì)胞降解 Matrigel的能力。1.6統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行分析，各組間比 較采用雙側(cè)t檢驗。2結(jié)果2.1對細(xì)胞增殖的影響2.1.1MTT法作用48 h后,25卩mol/L白藜蘆醇可抑制 Bel擬7404細(xì)胞增殖（P0.01）,且對Bel擬,7404細(xì)胞的抑制程度隨時間延長、齊 量增加呈

11、加大趨勢，白藜蘆醇達(dá)到較高濃度（100卩mol/L和200卩 mol/L）時，正常肝細(xì)胞L02和Bel擬7404細(xì)胞的生長均受到抑制 （P0.01,表 1）。2.1.2PCNA法計數(shù)結(jié)果與MTT法檢測結(jié)果基本吻合（表2）。白藜蘆醇濃度25卩mol/L時,可抑制Bel擬7404細(xì)胞的增殖（P0.01）;濃度100 卩mol/L時,正常肝細(xì)胞L02亦受到抑制（P0.01,圖1）。2.2對細(xì)胞凋亡的影響2.2.1流式細(xì)胞術(shù)50卩mol/L白藜蘆醇作用下，Bel擬7404細(xì)胞出現(xiàn)明顯的亞二倍體峰（圖2）,L02細(xì)胞則沒有。而100,200卩mol/L處 理組,2種細(xì)胞均出現(xiàn)了明顯的亞二倍體峰。2.2.

12、2TUNEL法在50卩mol/L白藜蘆醇作用下，Bel擬7404細(xì)胞數(shù)目 減少，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞（P0.01）;100 卩mol/L時丄02細(xì)胞也出現(xiàn)凋亡 （P0.01,圖3）,計數(shù)結(jié)果見表3。表1白藜蘆醇不同作用時間對Bel擬 7404細(xì)胞和L02細(xì)胞增殖的影響表中數(shù)據(jù)為 MTT法檢測的不同時間 段增殖細(xì)胞的D（550 nm）值.與對照組比較，:P0.05 ,:P0.01.表中數(shù)據(jù)為計數(shù)1 000個Bel擬7404細(xì)胞中PCNAB性細(xì)胞的百分率 （%）.與對照組比較，:P0.05 , :P0.01.2.3對肝癌Bel擬7404細(xì)胞侵襲的影響?zhàn)じ皆囼灒弘S作用時間的延 長,25,50卩mol/L的白

13、藜蘆醇表3TUNEL法檢測白藜蘆醇對 L02及 Bel擬7404細(xì)胞凋亡的影響表中數(shù)據(jù)為 TUNEL法檢測的陽性細(xì)胞百 分比（%）.與對照組比較，:P0.01.對Bel擬.7404細(xì)胞的黏附細(xì)胞外基質(zhì)FN能力均有明顯的抑制（P0.05,表4）,且抑制程度隨濃度增大而遞增；12.5卩mol/L無明顯 抑制作用（P0.05）。運動試驗：各種濃度的白藜蘆醇處理12 h對Bel 擬7404細(xì)胞的運動能力均無明顯的抑制作用（表5）。侵襲試驗:25,50 卩mol/L白藜蘆醇對Bel擬,7404細(xì)胞的降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力均有 明顯的抑制（P0.05,表5）,12.5卩mol/L的白藜蘆醇無明顯抑制作用 （

14、P0.05）。3討論白藜蘆醇是一種來源于虎杖、葡萄等常見植物、具有眾多生理藥理功能的天然藥物。近年來的研究表明，白藜蘆醇通過多種途徑對多種 腫瘤細(xì)胞（包括肝癌）有顯著抑制作用2。本研究顯示，一定濃度的白 藜蘆醇可抑制肝癌Bel擬7404細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而顯著抑 制Bel擬7404細(xì)胞的生長。有報道稱，白藜蘆醇可明顯抑制HL擬,60白血病細(xì)胞生長，而不影響 正常外周血液淋巴細(xì)胞3。小鼠口服較高劑量的白藜蘆醇,4周后檢 測各項血液生化指標(biāo)，表4白藜蘆醇對Bel擬7404細(xì)胞黏附纖連蛋 白能力的影響表中數(shù)據(jù)為 MTT法檢測的不同時間段黏附細(xì)胞的 D(550 nm)值.與對照組比較，:P0.

15、05, :P0.01.表5白藜蘆醇對 Bel 擬7404運動能力及侵襲能力的影響表中數(shù)據(jù)為運動實驗及侵襲實驗 中穿膜細(xì)胞數(shù)目.與對照組比較，:P0.01均未發(fā)現(xiàn)異常改變4。國內(nèi)研究顯示，白藜蘆醇能誘導(dǎo)膽囊癌 GBC 細(xì)胞凋亡而抑制其生長與增殖，但對正常成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞無此作 用5，提示白藜蘆醇可能對腫瘤細(xì)胞有選擇性抑制作用，而對正常細(xì) 胞無影響。本實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白藜蘆醇濃度較高時，不僅對肝癌細(xì)胞有顯 著的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，對正常肝細(xì)胞也產(chǎn)生類似的作用，特 別在200卩mol/L白藜蘆醇的作用下，肺癌細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞株均 受到顯著抑制，生長極為緩慢，顯微鏡下可見大量漂浮細(xì)胞和凋亡細(xì) 胞

16、。當(dāng)濃度較低時，白藜蘆醇對正常細(xì)胞無影響，對肝癌細(xì)胞仍有抑制 生長作用。因此可認(rèn)為，在一定濃度范圍內(nèi)，白藜蘆醇是一種低毒的肝 癌細(xì)胞抑制藥物；而超過這個濃度后，它對正常細(xì)胞也表現(xiàn)為抑制增 殖、誘導(dǎo)凋亡的毒性作用，并非如前述國內(nèi)外研究所認(rèn)為的對正常細(xì) 胞沒有影響3,6。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移極為復(fù)雜，從分子水平可大致分成3個過程:腫瘤細(xì)胞通過受體結(jié)合與胞外基質(zhì)中的FN和層黏連蛋白（LN）相黏附;腫瘤細(xì)胞沿著趨化劑的濃度梯度遷移；腫瘤細(xì)胞釋放各種水解酶類，溶 解、破壞其黏附部位的組織,使腫瘤細(xì)胞得以通過缺損游出而向遠(yuǎn)處 轉(zhuǎn)移5。通過設(shè)置前述的黏附、運動、侵襲3項實驗，可以在體外模 擬這幾個過程，觀察腫瘤

17、細(xì)胞的侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)，濃度較高的白 藜蘆醇（100卩mol/L）作用于肝癌細(xì)胞時,12 h即可抑制細(xì)胞生長，而 50卩mol/L白藜蘆醇至少需作用24 h才具有抑制瘤細(xì)胞增殖的作用， 筆者在對白藜蘆醇抑制肝癌細(xì)胞侵襲的研究中采用12.5,25,50卩mol/L 3種較低濃度的白藜蘆醇，作用肝癌細(xì)胞12 h,旨在反映白藜蘆 醇在不抑制細(xì)胞增殖的低濃度情況下是否具有抗侵襲作用。結(jié)果表明, 白藜蘆醇能顯著抑制肝癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)FN的黏附及對細(xì)胞外基質(zhì)降解的能力，而對肝癌細(xì)胞的運動能力無明顯抑制作用，提示白藜 蘆醇可能通過抑制腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)FN的黏附及降解基質(zhì)能力兩個環(huán)節(jié)發(fā)揮其抗腫瘤侵襲

18、的作用。有文獻報道，白藜蘆醇可通過抑制MM擬9 mRNA勺表達(dá)抑制MM擬9的活性，而MM朝9正是一種具 有降解基底膜基質(zhì)功能的酶，與腫瘤的侵襲密切相關(guān)7。本研究中白 藜蘆醇所顯示的抑制肝癌細(xì)胞降解基質(zhì)的作用是否與mM、9有關(guān)，尚待進一步探討?！緟⒖嘉墨I】1Jang M,Cai L,Udeani GO,et al.Cancer chemopreventive activity of resveratrol,a n atural product derived from grapesJ. Scienee, 1997,275（5297）:218 擬 220.2Notas G,Nifli A P,Kampa M,et al. Resveratrol exertsits antiproliferativeeffect on HepG2hepatocellular careinomacells,by in due ing cell cycle arrest,a nd NOS activati onJ.Biochim Biophys Acta, 2006,1760(11):1657 擬 1666.3ClementM V,Hirpara J L,Chawdhury S H,et al.