漆酶活性測定方法

1、一、測 O法2漆酶是一種多酚氧化酶,它所催化的反應(yīng)過程中有O z 的介入。測量反應(yīng)的耗氧量既可間接地推知漆酶的活性。較早建立的瓦氏呼吸器檢測法便是基于這一原理。這一方法后來改進為利用氧電極來測量耗氧量,如弗羅納等以愈創(chuàng)木酚為底物,利用氧電極測定了漆酶催化反應(yīng)過程中的耗氧量,并將 1個漆酶活性單位定義為PH6 . o 及2 5 條件下以愈刨木酚作為電子供體時消耗1. 0 mo lO2所需要的酶量。亦可取醌醇作底物.利用氧電極測定漆酶的活性。郭明高提出了測定生漆漆酶活性的吸氧法。即將生漆溶于甲苯,測定酶促吸氧速度和累計酶促吸氧量,同時利用堿促吸氧法測定反應(yīng)前后漆酚濃度的變化,從而可以求得漆酚濃度衰

2、減的規(guī)律及漆酶促吸氧的克分子比。此法的特點是反應(yīng)時漆酶處于其天然存l 在的狀態(tài)而反應(yīng)底物又恰為漆酶的天然底物漆酚,這在漆酶測活研究中尚屬首倒 2 1 。漆樹酶活力檢測用0.1m ol·L-1磷酸鹽緩沖液與有機溶劑配成一定體積的底物,其濃度為1.35×10 m ol·L-1。分別移取3mL于1cm測量池和參比池中,恒溫水浴中預(yù)熱10min.注入20L漆樹酶溶液(含酶23 g于測量池中,立即攪勻,測定350nm 處吸光度A隨時間的變化值.漆酶比活力定義為一定溫度下,單位酶量催化反應(yīng)的初速度,單位記為A(mg·min-1.將漆樹酶在不同溶劑體系中的比活力350

3、mm與漆樹酶在純水體系中的比活力相比,其比值稱活力比(212 漆酶活性的定量測定方法21211 分光光度計法測定漆酶活性對苯二胺(max495 、愈創(chuàng)木酚(max 485 、鄰苯二酚(max 400和漆酚(max 420都可用做漆酶活力測定的底物。不同來源(植物、細菌、昆蟲、真菌的漆酶與底物反應(yīng)的親和力不同 ,酶活性測定方法中所用的反應(yīng)底物、反應(yīng)條件以及酶活性單位定義對漆酶活性的測定結(jié)果有很大的影響。肖亞中等分別以2 ,2 2連氮二(32乙基苯并噻唑262磺酸 ,簡稱ABTS 、丁香醛連氮愈創(chuàng)木酚和鄰聯(lián)甲苯胺為底物 ,采用分光光度法測定蜜環(huán)菌( Armillaria mellea胞外漆酶的活力

4、 ,比較了這種底物對漆酶的敏感性 ,結(jié)果表明對于同一底物 ,反應(yīng)時間、溫度、緩沖液種類及其 pH值和酶的用量等條件對漆酶催化反應(yīng)都有不同程度的影響。鄰聯(lián)甲苯胺水溶性較差;愈創(chuàng)木酚為底物時反應(yīng)非常穩(wěn)定 ,但反應(yīng)時間長、測得的漆酶活性值偏低 ,已較少采用;以丁香醛連氮為底物時 ,漆酶活性值雖然較高 ,但當(dāng)?shù)孜锖兔敢河昧枯^大時反應(yīng)不穩(wěn)定 ,若采取減少底物和酶液用量的方法 ,可較大程度地克服反應(yīng)不易終止的缺陷。目前常以 ABTS 為底物 ,測定漆酶活性 ,反應(yīng)穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。21212 通過檢測酶與底物中間體來測定漆酶活性在酶反應(yīng)開始時產(chǎn)物生成量很少,而酶2底物中間體生成的速率較快。若采用初始速率法測

5、定中間體的濃度 ,可間接測定漆酶活性 ,大大提高方法靈敏度。用微量熱法測定漆酶的活性 ,樣品用量少 ,并且對酶的懸浮液體也能測定 ,適宜研究酶促反應(yīng).黃應(yīng)平等利用反相膠束介質(zhì)中漆酶氧化鄰苯二胺(OPDA反應(yīng)中間體動態(tài)吸收光譜來測定漆酶活性。該方法由于在反相膠束介質(zhì)中采用初始速率法進行測定 ,具有較高的靈敏度和選擇性。已報道的定量測定漆酶活性的方法還有 HPLC法、測氧法等。測氧法靈敏度低,操作繁瑣;HPLC法靈敏度高,但儀器昂貴;酶催化光譜分析法應(yīng)用較普遍,但一般是在水相中測定產(chǎn)物光譜信號變化,靈敏度較低。2 漆酶的酶活測定方法測定漆酶活性的方法有HPLC 法、測壓法、分光光度法、級譜法等。目

6、前常以3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS為底物, 測定酶對其的氧化速度。具體方法為: 反應(yīng)在25 下進行, 在總反應(yīng)體積 3 mL 中, 含有 2 mL 溶有 0.5 mmo lABTS 的 0.1 mmo lL 醋酸緩沖液(pH = 5. 0 , 添加酶液啟動反應(yīng), 在 420 nm 下測定其吸光值的變化。酶的活力單位定義為在上述條件下(25 , pH5. 0/(mL·m in .1 mL 酶液每分鐘氧化底物(ABTS引起吸光值的增加量(OD420Clemm ar J D 等以二茂鐵(Fc ·H 作為底物, 在二乙二醇單丁醚(DGBE磷酸緩沖液中, 用分光光度計在617

7、 nm 處測定漆酶的活性 1 該法無副產(chǎn)物干擾, 重復(fù)性好。望天志等采用微量熱法測定了漆酶的活性 1。對L KB-2107Batch 型微量熱系統(tǒng), 在溫度為298.15 K, pH 為 7.4 的條件下, 測定了漆酶的催化活性。該法的特點是用樣品量少, 并且對酶的懸浮液體也能測定, 宜用于研究酶促反應(yīng)。1.4 分析方法:測定漆酶酶活方法測定漆酶酶活有以下5種方法,我們選用第一種方法來測定酶活。以ABTS 為底物測定漆酶酶活是目前國外最為常見的方法之一。它有如下優(yōu)點: (1 ABTS 易溶于水,在室溫下放置6 個月仍較穩(wěn)定。 (2其反應(yīng)只有一步,即從ABTS 到它的陽離子自由基。ABTS 的陽

8、離子自由基在水溶液中呈淺藍綠色,且比較穩(wěn)定,通常在幾個小時或幾天之內(nèi)是穩(wěn)定的。 (3 在漆酶的作用下,ABTS 有色溶液的摩爾吸光系數(shù)較高,說明以其為底物測定的靈敏度較高。 (4 到目前為止,還未有報道稱ABTS 有致癌作用、誘變作用或是強烈的毒性。Wolfenden and Wilson 分別對5 mmol/ L ABTS加入20mol/ L 的抗壞血酸鹽的測定溶液,于不同波長進行了光譜掃描,發(fā)現(xiàn)純ABTS 呈淺藍綠色,且在415 nm 處有吸收峰;而加了抗壞血酸鹽的溶液為無色,在415 nm 處無吸收峰。 ABTS 的最大吸收峰在340 nm ,ABTS的陽離子自由基的最大吸收峰在415

9、nm. 由此推斷,在ABTS 的溶液中含有極少的ABTS 陽離子自由基,它們在更強的還原劑作用下被還原為ABTS。以ABTS 為底物進行漆酶的定量分析,通常在420 nm 下測定3 min 內(nèi)吸光度的變化。用這種底物進行定量分析有一個缺點,即ABTS 陽離子自由基溶液的吸光度受溶液中未反應(yīng)的ABTS 濃度的影響。這就產(chǎn)生了一個問題:420 nm 下的摩爾吸光系數(shù)36 000 L/ (molcm是在純ABTS 陽離子自由基的條件下求得的,而在實際測定反應(yīng)中,ABTS 是過量的,這就導(dǎo)致人們低估了酶活。這種影響不能忽視,因為反應(yīng)終止時,溶液中至少還要有1 mmol/ L的ABTS。盡管用ABTS

10、為底物存在上述問題,但是它仍是漆酶酶活測定的最佳底物之一。一般以ABTS 為底物,采用Glycine2HCl 緩沖體系、乙酸2乙酸鈉緩沖體系或檸檬酸鹽2磷酸鹽緩沖體系。如果菌種產(chǎn)生過氧化氫,為了準(zhǔn)確測定,需加入一定量的過氧化氫酶,用以破壞過氧化氫。因為在代謝過程中,菌體自身產(chǎn)生過氧化氫可激發(fā)木質(zhì)素過氧化物酶與錳過氧化物酶對ABTS 的氧化。丁香醛連氮( Syringaladazine也是漆酶酶活測定較為常見的底物之一。以丁香醛連氮為底物是將其氧化為相應(yīng)的醌,它的摩爾吸光系數(shù)為65 000 L/ (molcm。其摩爾吸光系數(shù)較大,可見用它定性測定漆酶的酶活具有較高的靈敏度。采用McIlvaine

11、 緩沖體系(pH = 5. 0 ,在525 nm 處測定吸光度的增加。以二茂鐵(Fe2H為底物的反應(yīng)方程式:Fe2H + e2Cu2 + e2Cu + + Fe 2H +e2Cu + + 4H+ + O2=e2Cu2 + + 2H2O - Fe2H 溶于水,呈藍色,在617 nm 處出現(xiàn)特征吸收峰,Fe2H 不對其發(fā)生干擾。因此,以二茂鐵為底物,用分光光度法測定漆酶活性準(zhǔn)確度較高,重復(fù)性較好。由于二茂鐵不溶于水,因此季立才等選親水性和疏水性都較好的DGBE 作溶劑,與0. 1mol/ L 磷酸鹽緩沖液以15 體積比混合后,使二茂鐵以一定濃度溶解,同時保持漆酶活性。季立才等從生漆中分離、純化漆樹

12、漆酶,并經(jīng)CM2Sephadex C50 柱層析,得藍色酶液、 3個組分,以二茂鐵為底物,用DGBE2磷酸鹽緩沖液(pH = 8. 0 ,在617 nm 處測定吸光度的增加。該方法無副產(chǎn)物干擾,簡便、準(zhǔn)確、易行。但目前使用并不廣泛,故用這種方法測定的酶活力的可比性不高。.還有其它一些用于漆酶酶活測定的底物,無論用哪一種底物進行測定,都有其自身的優(yōu)勢和不足。望天志采用L KB22107 Batch 型微量熱系統(tǒng),在溫度為298. 15K, pH = 7. 4 的條件下,測定了漆酶催化氧化底物3 ,4 ,5-三羥基苯甲酸、鄰苯三酚、鄰甲氧基酚的活性,用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制成pH = 7. 4

13、 的緩沖液。該法操作簡單,所用樣品量少,不需要光學(xué)透明的樣品,對酶的懸浮液也能直接測定,對反應(yīng)體系沒有任何限制或干擾。閻宏濤等首次采用脈沖激光光聲法測定了漆酶酶活。試驗了入射激光能量、激光照射時間和溫度變化等因素對漆酶活性的影響;建立了測定漆酶的光聲分析方法,檢測限為3g ,是一種高靈敏度的生物樣品分析方法。主要試劑: 1 mmol/ L ABTS溶液,ABTS 為美國Sig2ma 公司產(chǎn)品,精確稱取0. 0274g AB TS ,用蒸餾水定容至100 mL ,置于棕色瓶備用;Hac-NaAc(pH4.5緩沖溶液,18gNaAc,9.8mlHAc,用蒸餾水定容至1L,用pH計校準(zhǔn)其p H值。主

14、要儀器:UV - 2100 型紫外- 可見分光光度計,UNICO 尤尼柯(上海儀器有限公司;DELTA 320型pH計,METTLER TOLEDO 梅特勒-托利多儀器(上海有限公司。在25 時,以2mLBritton2Robinson 緩沖溶液,外加 1 mL 用蒸餾水稀釋104 倍的漆酶液為空白;先設(shè)定參數(shù),使吸光度自動歸零。取 1 mL 相應(yīng)pH 值的Britton2Robinson 緩沖溶液,用蒸餾水 1 mL 稀釋104 倍的漆酶液,再加1 mL 的1 mmol/ L AB TS 溶液于比L 的磷酸緩沖液(pH 6. 0 中反應(yīng), 測定 25 下 525 nm 處 4 吸光度的增量, 并 在不同的反應(yīng)時間測定酶 活力. 在實驗過程中發(fā)現(xiàn), 表 3 反應(yīng)時間和反應(yīng)條件對漆酶活力的影響 Effects of react ion t ime and react ion Tab . 3 condit ion on laccase act ivity 反應(yīng)時間 ö m in 酶活力 ö IU·L - 1 (不冰浴 酶活力 ö IU·