尿紅細(xì)胞THP免疫細(xì)胞化學(xué)染色確定血尿來源

1、    尿紅細(xì)胞THP免疫細(xì)胞化學(xué) 染色確定血尿來源        摘要收集48例有明確診斷的血尿患者新鮮尿標(biāo)本，用SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測尿紅細(xì)胞上被覆的Tamm-Horsfall蛋白(THP)以鑒別腎小球性血尿和非腎小球性血尿。結(jié)果顯示在22例腎小球性血尿中20例染色陽性(90.9%)，而在26例非腎小球性血尿中只有3例染色陽性(11.5%)，兩者差異有高度顯著性(P0.001)。認(rèn)為尿紅細(xì)胞THP免疫細(xì)胞化學(xué)染色法是一種確定血尿來源的可靠新方法。關(guān)鍵詞血尿T

2、amm-Horsfall蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)Immunocytochemical staining of erythrocytes in urine for tamm-horsfall protein in the differentiation of nonglomerular from glomerular hematuriaLuo Guangchen, Na Yanqun, Xia Tongli, et al. Department of Urology, Xiamen Zhongshan Hospital, Xia men 361004AbstractFresh urine samples

3、 were collected from 48 patients who have had hematuria with clinical di-agnosis already established. Stretaviden/Peroxidase immunocytochemical stai-ning was used for Tamm-Horsfall protein (THP) coating the erythrocytes in urine to discriminate glomerular and nonglomerular hematuria. Results showed

4、that 20 samples of 22 glomerular hematurias were stained positively (90.9%), while only 3 samples of 26 nonglomerular hematurias were positive (11.5%). It revealed that the immunocytochemical stai-ning of urinary erythrocytes for Tamm-Horsfall protein appears to be a reliable method to differentiate

5、 glomerular from glomerular hematuria (P0.001).Key wordsHematuria Tamm-Horsfall protein Immunocytochemistry血尿按來源可分為腎小球性血尿和非腎小球性血尿，兩種血尿的鑒別對病因診斷有很大幫助。腎小球來源的尿紅細(xì)胞表面被覆Tamm-Horsfall蛋白(THP)，而非腎小球來源的尿紅細(xì)胞表面則沒有，應(yīng)用THP抗體免疫標(biāo)記技術(shù)檢測THP來鑒別腎小球性血尿和非腎小球性血尿，具有客觀性強(qiáng)，敏感性和特異性高的優(yōu)點13。但文獻(xiàn)研究中所用的免疫標(biāo)記技術(shù)不常用，使其臨床應(yīng)用受到一定的限制。我們采用臨床病理免

6、疫染色中常用的SP法檢測尿紅細(xì)胞THP免疫染色確定血尿來源的可能性，以利于臨床更好地推廣應(yīng)用。臨床資料選擇自1996年11月1997年4月在北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿科和腎內(nèi)科住院的血尿患者48例，經(jīng)尿常規(guī)分析，證實有真性肉眼或鏡下血尿。分二組：(1)腎炎組22例。男性8例，女性14例。年齡1557歲，平均年齡29歲。其中腎小球腎炎17例，狼瘡性腎炎5例，均有腎臟穿刺病理結(jié)果。(2)腎后泌尿生殖道疾病組26例。男性19例，女性7例。年齡2887歲，平均年齡54歲。其中泌尿系結(jié)石11例(腎結(jié)石7例，輸尿管結(jié)石4例)有可靠的影像學(xué)證據(jù)，大多得到結(jié)石并作成分分析；腎盂癌2例，膀胱癌8例，膀胱炎1例，膀

7、胱結(jié)核1例，前列腺增生2例，前列腺導(dǎo)管腺癌1例，均有手術(shù)或活檢病理結(jié)果。方法一、主要試劑兔抗人THP抗體(中國原子能公司)，免疫組化染色SP試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。二、主要方法取新鮮尿標(biāo)本1030ml，以2 000r/min離心10分鐘，棄去上清液，滴加少許PBS緩沖液重新混懸，取一滴混懸液于載玻片上，自然風(fēng)干后，以冷丙酮固定10分鐘，然后染色。1%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物，室溫15分鐘；10%正常羊血清封閉非特異性染色，室溫20分鐘。然后，加入兔抗人THP抗體，室溫下孵育1小時；滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫下孵育30分鐘；滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫下孵育1小時；DA

8、B顯色510分鐘。最后蘇木精復(fù)染，封片鏡檢。在每次染色過程中均有腎小球性血尿和非腎小球性血尿病例，并設(shè)置以PBS緩沖液代替THP抗體的抗體替代對照。三、結(jié)果判定在顯微鏡下計數(shù)觀察紅細(xì)胞不少于50個，陽性細(xì)胞呈棕黃色，而陰性細(xì)胞不著色。著色紅細(xì)胞70%判定為腎小球性血尿，著色紅細(xì)胞30%為非腎小球性血尿，介于二者之間的為混合性血尿3。統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料2檢驗。結(jié)果在22例腎小球性血尿中，有20例染色與臨床診斷符合(90.9%)，2例不符，這2例的腎穿病理分別為型膜性腎病和局灶性階段性腎小球硬化。在26例非腎小球性血尿中，有23例染色與臨床診斷符合(88.5%)，3例不符，

9、這3例的臨床診斷分別是：腎結(jié)石1例，膀胱癌1例，前列腺導(dǎo)管腺癌1例。兩組結(jié)果經(jīng)2檢驗，差異有高度顯著性(P0.001)。尿紅細(xì)胞THP免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒別腎小球性血尿和非腎小球性血尿的靈敏性、特異性和總符合率分別為90.9%、88.5%、89.6%。討論無癥狀血尿，特別是無癥狀鏡下血尿，經(jīng)一些常規(guī)的檢查手段難以明確病因，這時做尿紅細(xì)胞定位檢查有重要意義。目前常用的定位診斷方法是尿紅細(xì)胞形態(tài)檢查，即紅細(xì)胞位相。這種檢查方法受尿樣的影響較大，并有較大的主觀性，有一組雙盲對比試驗表明，兩位有經(jīng)驗的觀察者可有38%的判定誤差4，5，使臨床應(yīng)用受到一定的限制。THP是腎小管髓袢升支粗段和遠(yuǎn)曲小管近段上皮

10、細(xì)胞分泌的一種大分子糖蛋白，作為尿中含量最多的蛋白質(zhì)，具有重要的生理功能，并參與許多疾病的病理過程。1987年，Abrass等1用免疫熒光標(biāo)記THP抗體，發(fā)現(xiàn)腎小球來源的尿中游離細(xì)胞(包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、上皮細(xì)胞等)被覆有THP。并作為鑒別腎小球疾病和非腎小球疾病的有效方法。其理論依據(jù)是腎小球來源的尿游離細(xì)胞經(jīng)過腎小管，從而被覆了一層THP。實驗中證實以含THP豐富的尿液或其它液體孵育紅、白細(xì)胞并不能使它們被覆上THP。關(guān)于其被覆機(jī)制目前尚未完全明了。Rindler等6通過轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，證實THP以磷脂酰肌醇與腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜緊密連接，由于磷脂酶或蛋白酶的作用而釋放。近來，有作者轉(zhuǎn)換角度，

11、單純通過檢測尿THP包被紅細(xì)胞來確定血尿的來源，使Abrass等的發(fā)現(xiàn)有了新的應(yīng)用價值2，3。他們以免疫酶標(biāo)技術(shù)代替免疫熒光技術(shù)，使敏感性大大提高。本研究選擇了目前臨床病理免疫染色工作中常用的SP染色法。這種方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)以及背景清晰、成本低廉的優(yōu)點，更有利于臨床推廣應(yīng)用，取得了滿意的結(jié)果。文獻(xiàn)中所有的腎小球性血尿均為陽性結(jié)果，符合臨床診斷，而本組22例中有2例陰性(9.1%)，這可能與染色技術(shù)有關(guān)，也可能與這2例尿紅細(xì)胞上被覆的THP太少有關(guān)。26例非腎小球性血尿中，有3例不符，其中2例結(jié)果判定為混合性血尿，1例判定為腎小球性血尿，與文獻(xiàn)結(jié)果類似。我們認(rèn)為，在BPH和腎結(jié)石中有少

12、部分呈混合性血尿或腎小球性血尿，這是由于它們引起腎臟損傷或腎功能損害的緣故。尿細(xì)胞THP免疫細(xì)胞化學(xué)染色是鑒別腎小球性血尿和非腎小球性血尿的一種可靠方法，雖然在應(yīng)用之前尚需要做更大規(guī)模的臨床驗證和建立標(biāo)準(zhǔn)，但相信它有很好的應(yīng)用前景。參 考文獻(xiàn)1Abrass CK, Laird CW. Tamm-Horsfall protein coating of free cells in urine. Amer J Kidney Diseases, 1987,994-97.2Janssens PM, Komaat N, Ticleman R, et al. Localization the site of

13、 hematuria by immunocytochemical staining of erythrocytes in urine. Clin Chem,1992,38216-222.3Fukkuzaki A, Kaneto H, Ikeda S, et al. Determining the origin of hematuria by immunocytochemical staining of erythrocytes in urine for Tamm-Horsfall protein. J Urol,1996,155248-251.4Goldwasser P, Antignani A, Avran MM. Effect of urine chemistry on red cells. Nephron, 1991,59328-329.5Raman GV, Pead L, Lee HA, et al. A blind control trial of phase contrary by two observers for evaluation the