色譜分析（中國(guó)藥科大學(xué)）第5章現(xiàn)代色譜技術(shù)簡(jiǎn)介

1、精品文檔第五章 現(xiàn)代色譜技術(shù)簡(jiǎn)介第一節(jié) 高效毛細(xì)管電泳分析法high performance capillary electrophoresis, HPCE一、 概述1、 開(kāi)展1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳第一次的自由溶液電泳。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬(wàn)/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速開(kāi)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的別離分析技術(shù)高效毛細(xì)管電泳分析法。2、 特點(diǎn) 儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化 分析速度快、別離效率高 操作方便、消耗少 應(yīng)用范圍極廣二、 高

2、效毛細(xì)管電泳理論根底1、 高效毛細(xì)管電泳(HPCE)根本原理電泳：帶電離子在電場(chǎng)中的定向移動(dòng)，不同離子具有不同的遷移速度。當(dāng)帶電離子以速度在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、方向相反的電場(chǎng)推動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作用。電場(chǎng)力：阻力：故：-離子所帶的有效電荷；-電場(chǎng)強(qiáng)度；-離子在電場(chǎng)中的遷移速度；-平動(dòng)摩擦系數(shù) ( 對(duì)于球形離子：,-離子的表觀液態(tài)動(dòng)力學(xué)半徑；-介質(zhì)的粘度)。所以，遷移速度：淌度mobility ：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下的平均電泳速度。淌度不同是電泳別離的根底。2、 電滲現(xiàn)象與電滲流(1) 電滲流現(xiàn)象當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體外表的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體外表的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲

3、現(xiàn)象。電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流electroosmotic flow ，簡(jiǎn)稱(chēng)EOF。 (2) HPCE中電滲流的大小與方向電滲流的大小用電滲流速度V電滲流表示，取決于電滲淌度和電場(chǎng)強(qiáng)度。電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)外表電荷的性質(zhì)： 內(nèi)外表帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極； 內(nèi)外表帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極； 石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；(3) HPCE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動(dòng)，電滲流的流動(dòng)為平流，塞式流動(dòng)譜帶展寬很??；液相色譜中的溶液流動(dòng)為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍引起譜帶展寬較大。(4) HPCE中電滲流

4、的作用 可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的別離； 改變電滲流的大小和方向可改變別離效率和選擇性； 電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性。3、 HPCE中影響電滲流的因素(1) 電場(chǎng)強(qiáng)度的影響 電滲流速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。(2) 毛細(xì)管材料的影響 不同材料毛細(xì)管的外表電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；(3) 電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響對(duì)于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時(shí)，外表電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢(shì)增大，電滲流增大，pH=7，到達(dá)最大；pH<3，完全被氫離子中和，外表電中性，電滲流為零。分析時(shí)，采用緩沖溶液來(lái)保持pH穩(wěn)定。緩沖溶液離子強(qiáng)度增加

5、，電滲流下降。(4) 溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。(5) 添加劑的影響 參加濃度較大的中性鹽如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減??； 參加外表活性劑，可改變電滲流的大小和方向，如參加陰離子外表活性劑，如十二烷基硫酸鈉SDS，電滲流增大； 參加有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。三、 HPCE中的參數(shù)1、 遷移時(shí)間保存時(shí)間2、 別離效率塔板數(shù)3、 別離度 四、 影響別離效率的因素區(qū)帶展寬(1) 縱向擴(kuò)散的影響在HPCE中，縱向擴(kuò)散引起的峰展寬。由擴(kuò)散系數(shù)和遷移時(shí)間決定。大分子的擴(kuò)散系數(shù)小，可獲得更高的別離效率大分子生物試樣別離的依據(jù)。(2)

6、進(jìn)樣的影響當(dāng)進(jìn)樣塞長(zhǎng)度太大時(shí)，引起的峰展寬大于縱向擴(kuò)散，別離效率明顯下降。(3) 焦耳熱與溫度梯度的影響 散熱過(guò)程中，在毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度中心溫度高，破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。改善方法：減小毛細(xì)管內(nèi)徑；控制散熱。(4) 溶質(zhì)與管壁間的相互作用 存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬。細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管柱，一方面有利于散熱，另一方面比外表積大，又增加了溶質(zhì)吸附的時(shí)機(jī)。改善方法：參加兩性離子代替強(qiáng)電解質(zhì)，兩性離子一端帶正電，另一端帶負(fù)電，帶正電一端與管壁負(fù)電中心作用，濃度約為溶質(zhì)的100-1000倍時(shí)，抑制對(duì)蛋白質(zhì)吸附，又不增加溶液電導(dǎo)，對(duì)電滲流影響不大。(5) 其他影響因素 電分散作用及“層流現(xiàn)象。五、

7、高效毛細(xì)管電泳的別離模式1、 毛細(xì)管區(qū)帶電泳capillary zone electrophoresis ，CZE最根本、應(yīng)用廣的別離模式電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出；中性粒子：無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出；陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反；V電滲流 >V電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類(lèi)別離,同種類(lèi)離子由于差速遷移被相互別離。2、 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC)緩沖溶液中參加離子型外表活性劑，其濃

8、度到達(dá)臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。在電場(chǎng)力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)。電泳流和電滲流的方向相反，且V電滲流 >V電泳，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)；中性分子在膠束相和溶液水相間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長(zhǎng)；色譜與電泳別離模式的結(jié)合。3、 其它別離模式 毛細(xì)管凝膠電泳capillary gel electrophoresis ，CGE 毛細(xì)管等電聚焦capillary isoelectric focusing，CIEF 毛細(xì)管等速電泳capillary isotachophoresis ，CITP 毛細(xì)管電滲色譜capillary electroosmo

9、stic chromatography ，CEC六、 應(yīng)用 離子分析 藥物分析 手性化合物分析 氨基酸分析 毛細(xì)管等電聚焦(CIEF) 核酸分析及DNA測(cè)序七、 進(jìn)展 微型化 聯(lián)用儀器 CE-MS 陣列毛細(xì)管凝膠電泳第二節(jié) 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)一、 概述開(kāi)展：Horning、20世紀(jì)70年代。特點(diǎn)：集液相色譜的高別離效能與質(zhì)譜的強(qiáng)鑒定能力于一體，對(duì)研究對(duì)象不僅有足夠的靈敏度、選擇性，同時(shí)還能夠給出一定的結(jié)構(gòu)信息，分析快速而且方便，具有其他分析方法所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)。地位：隨著接口技術(shù)的不斷開(kāi)展，液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)在藥物分析等領(lǐng)域的地位越來(lái)越重要,分析范圍更廣。二、 LC-MS的

10、根本組成LC-MS聯(lián)用儀的根本組成包括HPLC裝置、接口裝置與離子源、質(zhì)量分析器。1、 接口技術(shù)(1) 接口的作用 將洗脫劑及樣品分子氣化； 別離除去大量的洗脫劑分子； 完成對(duì)樣品分子的離解； 在樣品分子已經(jīng)電離的情況下，最好能進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離CID。(2) 接口的種類(lèi)LC-MS采用過(guò)的接口：直接液體導(dǎo)入接口(DLI)、傳送帶接口(MBI)、粒子束接口(PBI)、熱噴霧接口(TSI)、大氣壓離子化接口(API)、電噴霧接口(ESI)、音噴離子化接口(SSI)、動(dòng)態(tài)快原子轟擊接口(FAB)、等離子體噴霧接口(PSP)、基質(zhì)輔助激光解吸離子化接口(MALDI)等。大氣壓離子化(API)接口的應(yīng)用,

11、徹底改變了LC/MS的面貌。使其迅速成為體內(nèi)藥物分析中應(yīng)用最廣的分析儀器。三、 大氣壓離子化接口技術(shù)API1、 分類(lèi) 電噴霧離子化(electrospray ionization, ESI) 氣動(dòng)輔助電噴霧離子化(pneumatically assisted electrospray ionization) 大氣壓化學(xué)離子化(atmospheric pressure chemical ionization, APCI) 它們的共同點(diǎn)是樣品的離子化在處于大氣壓下的離子化室內(nèi)完成，離子化效率高，大大增強(qiáng)了分析的靈敏度和穩(wěn)定性。2、 電噴霧離子化ESI(1) 工作原理及結(jié)構(gòu)示意圖樣品溶液通過(guò)毛細(xì)管導(dǎo)

12、入大氣壓電離源內(nèi)，在氣化氣的幫助下和源內(nèi)毛細(xì)管終端與反電極之間強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，樣品溶液形成帶電荷的霧，即電噴霧。這些霧滴在熱氮?dú)饬飨抡舭l(fā)，半徑逐漸縮小，霧滴外表的電場(chǎng)不斷增強(qiáng)到某一臨界點(diǎn)時(shí)發(fā)生離子的場(chǎng)發(fā)射，或溶劑完全蒸發(fā)。生成的樣品氣相離子經(jīng)質(zhì)量分析器分析，測(cè)得它們的質(zhì)荷比。ESI過(guò)程： 靜電噴霧 去溶劑 離子蒸發(fā)。(1) 特點(diǎn) 高的離子化效率； 多種離子模式供選擇； “軟離子化方式使熱不穩(wěn)定化合物得以分析并產(chǎn)生高豐度的準(zhǔn)分子離子峰；(2) 應(yīng)用 小分子藥物及其各種體液內(nèi)代謝物的測(cè)定 農(nóng)藥及化工產(chǎn)品的中間體和雜質(zhì)鑒定 大分子的蛋白質(zhì)和肽類(lèi)的分子測(cè)定 氨基酸測(cè)序及結(jié)構(gòu)研究 分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用3

13、、 大氣壓化學(xué)離子化APCI(1) 工作原理及結(jié)構(gòu)示意圖在大氣壓條件下采用電暈放電方式使流動(dòng)相離子化，然后流動(dòng)相作為化學(xué)離子化反響氣氣相試劑使樣品離子化。樣品分子的離子化通過(guò)質(zhì)子化或電荷轉(zhuǎn)移來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，還可通過(guò)去質(zhì)子樣品為酸，電子捕獲鹵素、芳香化合物及形成加合物如、的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。(2) 特點(diǎn) 軟電離接口技術(shù)； 電離過(guò)程只產(chǎn)生單電荷峰，非常適合弱極性小分子化合物的測(cè)定； APCI還與高流量的梯度洗脫和上下水溶液變換的流動(dòng)相兼容，通過(guò)調(diào)解離子源電壓，可以得到不同斷裂程度的質(zhì)譜圖。 四、 質(zhì)量分析器1、 四極桿質(zhì)譜儀quadrupole mass spectrometer(1) 工作原理及結(jié)構(gòu)示意

14、圖離子從一端進(jìn)入四極桿，沿z方向恒速前進(jìn)，由于在四極桿上加了直流電壓和射頻磁場(chǎng)Vrf,離子在x軸和y軸方向進(jìn)行復(fù)雜振蕩。有一個(gè)穩(wěn)定的振蕩能是特定的離子從四極桿的一端飛到另一端而沒(méi)有碰到電極上。這一振蕩取決于一個(gè)離子的質(zhì)荷比。因此在一定條件下，僅一個(gè)質(zhì)荷比的離子通過(guò)四極桿，其它離子由于不穩(wěn)定的振蕩將會(huì)碰到四極桿上而喪失。(2) 特點(diǎn) 在較低的真空度下工作； 掃描速度較快，有利于色譜儀聯(lián)用； 四極質(zhì)譜儀為低分辨率儀器； 掃描時(shí)間短<100ms,特別適合色譜峰的實(shí)時(shí)掃描； 缺點(diǎn)：四極質(zhì)譜儀還有質(zhì)量歧視效應(yīng)。 2、 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀time-of-flight mass spectrometer,

15、 TOF MS(1) 工作原理及結(jié)構(gòu)示意圖其中由103104V的電場(chǎng)脈沖將離子源產(chǎn)生的樣品離子加速到無(wú)場(chǎng)的飛行管內(nèi)。所有離子進(jìn)入到飛行管內(nèi)時(shí)具有相同的動(dòng)能，但他們的飛行速度與它們的質(zhì)量成反比，輕的離子較重的離子早飛行到達(dá)檢測(cè)器，典型的飛行時(shí)間時(shí)130µm。(2) 特點(diǎn) 靈敏、分辨率高、快速； 理論上質(zhì)量范圍無(wú)限； 可以得到化合物的精確質(zhì)量數(shù)； 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。3、 其它質(zhì)量分析器 離子阱質(zhì)譜儀ion trap mass spectrometer, ITMS 傅立葉變換質(zhì)譜儀Fourier transform mass spectrometer, FTMS 扇形磁場(chǎng)質(zhì)譜儀magnetic sector mass spectrometer4、 串聯(lián)質(zhì)譜三級(jí)四極桿質(zhì)量分析器trilple-quadrupole analyzer空間串聯(lián)質(zhì)譜法由三個(gè)順序連接的四極桿