共焦顯微鏡在真菌性角膜炎臨床診斷中的應(yīng)用

1、    共焦顯微鏡在真菌性角膜炎 臨床診斷中的應(yīng)用        【摘要】目的評價共焦顯微鏡(confocal microscopy)在真菌性角膜炎(fungal keratitis)臨床診斷中的應(yīng)用價值。方法利用共焦顯微鏡對臨床擬診為真菌性角膜炎的43例患者進(jìn)行檢查，并用雙盲法同時行涂片或活體檢查真菌菌絲，對兩組結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果43例患者中，31例行共焦顯微鏡檢查可見真菌，綜合各項檢查結(jié)果并結(jié)合臨床表現(xiàn)，32例確診為真菌性角膜炎，共焦顯微鏡的確診率為96.9%。

2、結(jié)論共焦顯微鏡檢查是一種快速、有效和無損害的活體檢查手段，在真菌性角膜炎的早期診斷、治療和研究中將起重要作用?！娟P(guān)鍵詞】顯微鏡檢查，共焦角膜眼感染，真菌性Clinical diagnosis of fungal keratitis by confocal microscopyXIE Lixin, LI Shaowei, SHI Weiyun, et al.Institute of Ophthalmology, Shandong Academy of Medical Sciences, Qingdao 266071【Abstract】ObjectiveTo illustrate the valu

3、e of confocal microscope in the diagnosis of fungal keratitis. MethodsIn vivo confocal microscopy was performed on 43 patients of suspected fungal keratitis. The results were compared to that of smears and biopsies. ResultsFungal filaments were imaged in 31 of 43 patients' corneas. Fungal kerati

4、tis was diagnosed in 32 patients based on clinical signs and all the methods of examinations. The positive rate of confocal microscopy is 96.9%. ConclusionConfocal microscopy can be a rapid, effective and noninvasive imaging technique, and it is helpful in the diagnosis, treatment and study of funga

5、l keratitis.【Key words】Microscopy, confocalCorneaEye infections, fungal真菌性角膜炎是一種危害嚴(yán)重的致盲性疾病，其中的一個主要原因是由于缺乏有效的早期診斷方法，從而常導(dǎo)致誤診并延誤治療。眼科共焦顯微鏡的出現(xiàn)，使真菌性角膜炎的早期診斷成為可能。共焦顯微鏡是一種新型、無創(chuàng)傷性角膜影像學(xué)檢查儀器，它可以在活體上對角膜從四維(三維空間和時間)水平進(jìn)行掃描成像，并提供高清晰度和放大倍率的角膜各層面像，使人們可以從細(xì)胞水平上對活體角膜的病理生理進(jìn)行直接觀察研究1。目前已經(jīng)有人將此技術(shù)應(yīng)用于阿米巴等感染性角膜炎的臨床診斷2，僅見2例用于真

6、菌性角膜炎的個案報道3。為積累其應(yīng)用經(jīng)驗，并對共焦顯微鏡檢查用于真菌性角膜炎臨床診斷的價值進(jìn)行評價，我們采用日本Tomey公司生產(chǎn)的CONFOSCAN共焦顯微鏡對43例(均為單眼)臨床擬診為真菌性角膜炎的患者進(jìn)行檢查，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。資料和方法1.一般資料：選擇本院門診患者43例，男35例，女8例；年齡1872歲。病程1周至2個月。角膜潰瘍面積為2 mm×2 mm至全角膜，部分患者伴有前房積膿。均為抗生素藥物治療無效或按潰瘍形態(tài)特征，而被擬診為真菌性角膜炎者。2.先行常規(guī)的角膜分泌物涂片或取病變處角膜組織活檢，加10%氫氧化鉀后在生物顯微鏡下查找真菌菌絲和孢子。然后再行共焦顯微鏡檢

7、查，將兩種檢查的結(jié)果進(jìn)行對照，如兩種檢查結(jié)果不一致，立即再次重復(fù)檢查。3.共焦顯微鏡檢查方法：患眼用0.4%鹽酸丁氧普魯卡因液滴眼2次，開瞼器開瞼，患者的下頜及前額固定在顯微鏡上的檢查托架上。在40倍水浸式圓錐狀物鏡(achroplan 40/0.75 W)表面涂等張的人工淚液(Vidisic-Gel)，將鏡頭輕緩前移，使表面的人工淚液與角膜病變處接觸，鏡頭與角膜之間的距離為2 mm。將鏡頭緩緩前移，角膜各層的掃描像即可通過電腦顯示器快速顯示，像同時被S-VHS錄像機(jī)記錄，檢查結(jié)束后慢放錄像，仔細(xì)分鏡頭重復(fù)檢查，選定清晰像存入計算機(jī)，微機(jī)軟件可對1 m的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測量和分析，然后由打印機(jī)打出結(jié)果

8、。像也可由Sony Up-860 Video graphic printer直接打出，或用幻燈制作系統(tǒng)拍照以供發(fā)表。結(jié)果綜合各項檢查結(jié)果和臨床表現(xiàn)，43例患者中32例確診為真菌性角膜炎。首次常規(guī)潰瘍面涂片和活體檢查，43例中20例查到了不同形態(tài)的菌絲。共焦顯微鏡檢查到的31例陽性患者，其中包括上述20例中的19例；1例活檢陽性者，共焦顯微鏡仔細(xì)復(fù)查仍未查到菌絲。而共焦顯微鏡檢查陽性，涂片或活檢陰性的12例中，經(jīng)反復(fù)涂片和活檢又有8例查到了菌絲。共焦顯微鏡顯示的菌絲像是在相對暗的背景中的明亮的線狀形態(tài)(1)，在一些病例中也可見到孢子，其形態(tài)和菌絲分支的角度同活檢標(biāo)本的鏡下觀相似，多數(shù)的菌絲直徑&

9、lt;6 m，孢子直徑約1020 m(2)。1角膜潰瘍處明亮的絲狀線條（箭頭），直徑約36 m共焦顯微鏡×40/0.752 角膜潰瘍內(nèi)可見大量菌絲(長箭頭)和孢子(短箭頭)，菌絲直徑約610 m共焦顯微鏡×40/0.75討論1.共焦顯微鏡診斷真菌性角膜炎的優(yōu)點：目前，真菌性角膜炎的臨床診斷方法有多種，常見的有涂片法、組織活檢法和體外培養(yǎng)法，也有人用活體的免疫熒光法。但是，這些方法均存在缺陷。涂片和活檢的方法，在取不到菌絲時可造成假陰性，往往需要反復(fù)多次檢查才能得到陽性結(jié)果，不但費時，而且會對角膜增加創(chuàng)傷使炎癥擴(kuò)散。此外，操作者的手法和醫(yī)師的臨床經(jīng)驗對結(jié)果的可靠性影響也較大。

10、本研究首次涂片和活檢的陽性率僅為62.5%(20/32)，經(jīng)反復(fù)檢查后才達(dá)到87.5%(28/32)。體外培養(yǎng)的方法同樣也受到取樣的影響，一般需要2周以上才能有陽性結(jié)果，要確定陰性結(jié)果至少需3周以上。因此不利于臨床治療。目前應(yīng)用較少的免疫熒光法，也存在試劑的敏感性問題。共焦顯微鏡卻具有其它方法不能比擬的優(yōu)點：(1)對角膜無損傷，檢查時鏡頭并未與角膜直接接觸，而是通過一種對角膜有保護(hù)作用的等張人工淚液進(jìn)行檢查。(2)可在數(shù)十秒至幾分鐘內(nèi)對角膜進(jìn)行全面的檢查。由于它可以每秒24次掃描的速度對角膜進(jìn)行連續(xù)的斷層成像，因此，幾乎角膜上任何細(xì)小的變化均可以捕捉到。(3)真菌檢查的陽性率高。本組共焦顯微鏡

11、對真菌檢查的陽性率為96.9%(31/32)。而在本組全部32例陽性患者中，盡管進(jìn)行了反復(fù)的涂片和活檢，仍有4例未能查到真菌，而共焦顯微鏡卻查到了清晰的菌絲。4例中，2例潰瘍直徑為<2 mm，1例已經(jīng)在外院應(yīng)用抗真菌藥物并反復(fù)進(jìn)行潰瘍刮片，1例為角膜層間膿腫，角膜表面已經(jīng)難以刮到菌絲。因此，共焦顯微鏡既可以對真菌性角膜炎進(jìn)行早期診斷，同時也可以觀察療效并指導(dǎo)治療。2.共焦顯微鏡診斷真菌性角膜炎的注意事項：因為真菌性角膜炎主要是由曲霉菌、鐮刀菌等絲狀菌和能產(chǎn)生假菌絲的念珠菌所引起，故我們對真菌性角膜炎的診斷主要是以檢測到菌絲為依據(jù)。但也同樣觀察到了真菌胞子，它們的直徑一般>10 m，

12、而且具有區(qū)別于角膜基質(zhì)細(xì)胞的特殊形態(tài)，這些真菌的形態(tài)與生物顯微鏡下所見相似，故只要有相應(yīng)的專業(yè)知識也不難識別。但是，目前對各種真菌的共焦顯微鏡的像特點不詳，進(jìn)行精確的菌種鑒別尚有困難。如果根據(jù)培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行菌種鑒定，再對照各個菌種的共焦顯微鏡像，可能會對一些真菌菌種的成像特點有所認(rèn)識，甚至達(dá)到通過共焦顯微鏡對真菌進(jìn)行初步分型診斷。另外，檢查者應(yīng)當(dāng)對角膜基質(zhì)神經(jīng)干和上皮下神經(jīng)分支有所認(rèn)識，以免誤診為菌絲。基質(zhì)神經(jīng)干的直徑一般為20 m以上，而上皮下的神經(jīng)分支多而雜亂。在行共焦顯微鏡檢查時，應(yīng)注意以下事項：(1)檢查前應(yīng)充分進(jìn)行表面麻醉，這樣可以防止由于刺激引起患者流淚，稀釋粘稠劑而影響像的采集。

13、(2)線狀開瞼器的應(yīng)用是十分必要的，尤其是對一些眼部刺激較重的患者，可以防止睫毛和眼瞼對粘稠劑的影響，并可充分暴露角膜。(3)在病變區(qū)域的像有很強(qiáng)的反光，不容易辨別菌絲，應(yīng)適當(dāng)降低光的亮度。這樣形成的像是背景較暗的、被破壞的、無結(jié)構(gòu)的角膜組織，而菌絲則呈較亮的線狀，對比非常鮮明。再者，降低光的強(qiáng)度也可以減輕強(qiáng)光對患者的刺激。另外，病變邊緣的像較清晰，可見較典型的角膜基質(zhì)細(xì)胞，以及侵入其間的菌絲。(4)當(dāng)感染波及角膜全層時，共焦顯微鏡對深層的菌絲和組織難以檢查出清晰的像，只能對淺層菌絲進(jìn)行檢測。這是因為太厚的病變角膜壞死組織與菌絲的折光強(qiáng)度相似，另外，本研究的共焦顯微鏡用的是普通燈光源，其穿透能

14、力有限，尤其當(dāng)角膜混濁嚴(yán)重時，其光線的穿透力和反射回來的光線均會顯著下降，這將明顯影響成像質(zhì)量。據(jù)報道，一些激光光源的共焦顯微鏡成像效果較好，但對患者可能有潛在的危害1。(5)一些菌絲的像對比度欠佳，可能與不同菌種的光線曲折力不同有關(guān)3。本組患者中唯一的1例共焦顯微鏡未能查出的菌絲，可能與此有關(guān)，因為該患者的菌絲在生物顯微鏡下的對比度也很低，比較難以辨認(rèn)。因此，究竟有哪些菌種比較難以檢查，目前尚缺乏這方面的經(jīng)驗。由于共焦顯微鏡是一種新的檢查儀器，人們是首次從這樣一個角度和方式對角膜進(jìn)行活體觀察，目前有許多現(xiàn)象尚不能為我們所了解。但是，作為一種無創(chuàng)傷性的快速診斷工具，共焦顯微鏡在真菌性角膜炎的早

15、期診斷和治療過程中有著重要的作用和顯著的優(yōu)點，在對該病的病理特點的研究中也有著巨大的潛力，但所有這些均有待于進(jìn)一步的探討。作者單位：謝立信李紹偉史偉云韓冬生（266071 青島，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院眼科研究所）參考文獻(xiàn)1Cavanagh HD, Petroll WM, Alizadeh H, et al. Clinical and diagnostic use of in vivo confocal microscopy in patients with corneal disease. Ophthalmology, 1993, 100:1433-1454.2Pfister DR, Cameron JD, Krachmer JH, et al. Confocal microsco