肝炎的分子診斷與臨床應用ppt課件

1、 肝炎分子診斷項目開展介紹肝炎分子診斷項目開展介紹11、了解肝炎分子診斷2、分子診斷在HBV中的臨床應用3、分子診斷在HCV中的臨床應用4、ADICON已開展的肝炎分子診斷項目2 我國乙肝病毒感染率概況我國乙肝病毒感染率概況3 2006200620102010年全國乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃年全國乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃顯示，中國是乙型肝炎病毒感染和發(fā)病人數最多的國顯示，中國是乙型肝炎病毒感染和發(fā)病人數最多的國家，全國有家，全國有6.96.9億億人曾感染過乙肝病毒，其中人曾感染過乙肝病毒，其中1.21.2億億人人長期攜帶乙肝病毒。長期攜帶乙肝病毒。目前全國慢性乙肝病人目前全國慢性乙肝病人200020

2、00萬萬人，每年死于與乙人，每年死于與乙肝相關的肝病患者達肝相關的肝病患者達2828萬萬例，發(fā)病率和死亡率都位居例，發(fā)病率和死亡率都位居前三位。每年造成的直接經濟損失約達前三位。每年造成的直接經濟損失約達36003600億億元人民元人民幣。幣。我國乙肝病毒感染率概況我國乙肝病毒感染率概況4 在臨床上應用核酸（在臨床上應用核酸（DNA/RNA) DNA/RNA) 和分子生物和分子生物學技術學技術, , 在基因水平診斷和監(jiān)控疾病情況在基因水平診斷和監(jiān)控疾病情況和療效，評估疾病的檢測方法。和療效，評估疾病的檢測方法。5HBV HBV 分子診斷的分子診斷的臨床應用臨床應用高靈敏度高靈敏度HBV DNA

3、HBV DNA定量定量HBV 感染監(jiān)測藥物療效檢測感染早期檢測HBV HBV 基因分型基因分型病情預后發(fā)展檢測抗病毒藥物效果預測P P區(qū)耐藥檢測區(qū)耐藥檢測抗藥性監(jiān)測治療藥物選擇S S 區(qū)變異區(qū)變異確定隱覓性病毒變異判斷疫苗效果判斷肝炎預后C C區(qū)啟動子變異區(qū)啟動子變異確定病毒變異類型判斷治療效果確定治療方案+高精度病毒載量檢測系統(tǒng)（ COBAS AmpliPrep/Cobas TaqMan ）7+定量PCR技術檢測患者的血清HBVDNA含量，能更準確地反映病毒復制程度，對HBV相關疾病的診斷、治療、判斷預后意義重大。+QF-PCR是國內常用的定量檢測血清HBVDNA水平的方法，COBAS 系統(tǒng)

4、是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準用于血清HBVDNA定量檢測的方法。它具有靈敏度高，線性范圍廣，實時監(jiān)控，重復性好，可檢測A、B、C、D、E、F、G、前C區(qū)變異等多基因型DNA載量優(yōu)點。+由于本QF-PCR試劑盒的線性范圍為1.0 x 103 copiesmL1.0 x 108 copiesmL，對于低于1.0 x 103 copiesmL標本的檢測結果不能給出具體拷貝值，有存在漏檢的可能。 而COBAS 系統(tǒng)線性范圍為20-1.7108 IU/mL，因此， COBAS 系統(tǒng)更能準確反映血清HBV DNA含量。8COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test,

5、 v2.0檢測靈敏度20 IU/mL 線性范圍20 1.7 x 108 IU/mL檢測基因型A-H檢測樣本量650 mLSample Type血清或EDTA抗凝血漿SFDA注冊證Q39高靈敏度高靈敏度乙肝：乙肝：20 IU/mL準確判斷治療起點準確判斷治療起點/ /終點終點線性范圍線性范圍乙肝：乙肝：20-1.720-1.710108 8 IU/mLIU/mL極佳的重復性，結果可靠極佳的重復性，結果可靠正確指導抗病毒治療正確指導抗病毒治療每批試劑均使用每批試劑均使用WHOWHO標準品校準標準品校準保證定量結果的準確性保證定量結果的準確性和可溯源性和可溯源性每個樣本使用同每個樣本使用同源性內標定

6、量源性內標定量避免結果不準確避免結果不準確采用采用AmpEraseAmpErase酶酶減少交叉污染減少交叉污染目前在目前在國內唯一國內唯一滿足治療指南和專家共識的滿足治療指南和專家共識的HBV HBV DNADNA和和 HCV RNAHCV RNA檢測試劑檢測試劑10部分病毒學應答部分病毒學應答60 2,000 IU/mL加其他藥物治療每3個月監(jiān)測HBV DNA開始治療開始治療- - 基于基于 HBV DNAHBV DNA、 ALTALT水平和疾病發(fā)展階段水平和疾病發(fā)展階段治療第治療第1212周評估是否存在原發(fā)性無應答周評估是否存在原發(fā)性無應答 (較基線下降1 log)治療第治療第2424周評

7、估周評估完全病毒學應答完全病毒學應答 2,000 IU/mL改用或加用更強藥物每6個月監(jiān)測HBV DNA*Keefe, E. Clin Gastro Hepatology. 2007; (5):890-897. 抗病毒治療應將HBV DNA降至盡可能低的濃度，理想是低于實時定量 PCR方法（靈敏度靈敏度10-15 IU/mL10-15 IU/mL）的最低檢出限1 1. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-24211HBsAgHBsAg清除及血清學轉換清除及血清學轉換治療終點治療終點ALTALT正常正常組織學改善組織學改善HBV DNAH

8、BV DNA降低降低/ /消失消失HBeAgHBeAg血清學轉換血清學轉換HBeAgHBeAg消失消失cccDNA cccDNA 清除清除*Lok, A.S.F et.al. “Chronic Hepatitis B: Update 2009.” HEPATOLOGY, Vol 50, No. 3, 2009, pgs 8-9 12+ 20092009年年EASLEASL指南提出的治療終點：指南提出的治療終點：+最最理想的理想的治療終點：持續(xù)的治療終點：持續(xù)的HBsAg HBsAg 消失，伴或不消失，伴或不伴抗伴抗HBs HBs 抗體出現?？贵w出現。+滿意的滿意的治療終點：在治療終點：在HBe

9、 Ag HBe Ag 陽性患者中，出現陽性患者中，出現持續(xù)的持續(xù)的HBeAg HBeAg 血清轉換血清轉換+次級的滿意次級的滿意治療終點：盡可能降低病毒治療終點：盡可能降低病毒DNADNA水水平（降至實時定量平（降至實時定量 PCRPCR檢測限以下：檢測限以下：10-10-15IU/ml15IU/ml）13根據根據HBVHBV全基因核苷酸序列的差異，分為不同全基因核苷酸序列的差異，分為不同基因型基因型: :A.B.C.D.E.F.G.H共8個型 不同的基因型具有不同地域分布不同的基因型具有不同地域分布 我國主要是BC型為主，偶有A型 北方C型特征基因型基因型B B型型C C型型感染性感染性低高

10、HbeAgHbeAg陽性率陽性率低高HbeAgHbeAg自然清除時間自然清除時間短長HBV DNAHBV DNA載量載量低高致病性致病性輕重HCCHCC發(fā)生率發(fā)生率低（低年齡組高）高（高年齡組高）干擾素治療完全應答率干擾素治療完全應答率高低抗病毒治療效果抗病毒治療效果高低肝癌手術治療預后肝癌手術治療預后好差癌栓栓塞治療效果癌栓栓塞治療效果好好差+乙肝病毒:高變異性 1/105 +24h 一萬億-十萬億拷貝*變異：一千萬一億+復制過程:DNA-RNA-DNA+HBV逆轉錄酶:缺乏嚴格的校正機制+變異:自然變異,免疫壓力等等16原本有效的藥物原本有效的藥物對發(fā)生耐藥變異后的病毒束手無策對發(fā)生耐藥變

11、異后的病毒束手無策變異前，藥物有效抑制病毒變異后，藥物對病毒束手無策乙肝病毒乙肝病毒P P區(qū)耐藥區(qū)耐藥1718+長期使用抗病毒藥物可引起HBV耐藥，引起耐藥的基因突變位點主要集中于P區(qū)+原因：抗病毒藥物作用在病毒P區(qū)藥物靶點上，引起相關基因變異，使得藥物與相關靶點作用下降，進而產生耐藥。19原發(fā)無應答原發(fā)無應答病毒學（部分）病毒學（部分）應答應答臨床耐藥2021 耐藥病毒的出現使后續(xù)治療的藥物療效降低耐藥病毒的出現使后續(xù)治療的藥物療效降低 耐藥病毒的出現抵消了之前獲得的臨床益處耐藥病毒的出現抵消了之前獲得的臨床益處病毒反彈病毒反彈, , 血清轉氨酶升高血清轉氨酶升高, HBeAg, HBeAg

12、血清轉換率降低血清轉換率降低肝臟病理進展肝臟病理進展肝硬化病人出現肝功能失代償和死亡肝硬化病人出現肝功能失代償和死亡肝移植后肝炎復發(fā)率增高肝移植后肝炎復發(fā)率增高 公共衛(wèi)生危害公共衛(wèi)生危害耐藥病毒株的傳播耐藥病毒株的傳播免疫逃逸免疫逃逸2223拉米夫定拉米夫定, ,阿德福韋阿德福韋, ,恩替卡韋為基因型耐藥發(fā)生率恩替卡韋為基因型耐藥發(fā)生率, ,替比夫定為因耐藥發(fā)生的病毒學反彈發(fā)生率替比夫定為因耐藥發(fā)生的病毒學反彈發(fā)生率24+長期使用抗病毒藥物可引起HBV耐藥，引起耐藥的基因突變位點主要集中于P區(qū)+耐藥基因分析在臨床藥物選擇上的應用 目前最常見P區(qū)耐藥位點11個（169、173、180、181、1

13、84、194、202、204、233、236、250）25 拉米夫定 M204I/V L180M V173L 恩曲他濱 V173L L180M M204I/V 阿德福韋 A181V N236T 恩替卡韋 T184A（G/I/S) M250V 特比夫定 M204I/V常用抗病毒藥物的耐藥位點常用抗病毒藥物的耐藥位點26常見變異的交叉耐藥性敏感敏感界于中間界于中間耐藥耐藥271.一種藥物產生耐藥時，需要用具有不同耐藥位點藥物代替2.為減少耐藥情況，建議從治療開始就使用具有兩種不同耐藥位點藥物一起治療3.由于抗病毒藥物的耐藥以及治療的長期性，在治療過程中應該定期檢查，或是在發(fā)現藥物治療效果不佳時需排

14、除產生耐 藥的可能28檢測檢測檢測檢測29+目前檢測的變異位點： P區(qū)耐藥位點11個（169、173、180、181、184、194、202、204、 233、236、250）+專門檢測LAM變異位點：180，181，204，173+專門檢測ADV變異位點：181，233，23630艾迪康醫(yī)學檢驗中心艾迪康醫(yī)學檢驗中心P P區(qū)基因變異檢驗報告單區(qū)基因變異檢驗報告單樣張樣張 31l傳播途徑傳播途徑: :主要血液主要血液/ /體液傳播體液傳播( (似似HBV)HBV)l是引起輸血后慢性肝炎和肝硬化主要原因是引起輸血后慢性肝炎和肝硬化主要原因l無癥狀無癥狀HCVHCV攜帶者和慢性丙肝者多見攜帶者和慢

15、性丙肝者多見l感染感染HCVHCV后，慢性化的比例高達后，慢性化的比例高達50%50%以上以上l免疫力不牢固免疫力不牢固黃病毒科黃病毒科 丙型肝炎病毒屬丙型肝炎病毒屬球形有包膜的球形有包膜的RNARNA病毒，直徑病毒，直徑50nm50nm病毒基因為單股正鏈病毒基因為單股正鏈RNARNA，鏈全，鏈全 長約長約10Kb10Kb32 HCV RNA HCV RNA 檢測檢測 確定引起病毒性肝炎的直接原因 通過病毒數量變化來監(jiān)測治療效果33實時熒光實時熒光PCRPCR法：法：檢測三個基因型（檢測三個基因型（1 1型、型、2 2型、型、3 3型）型）PCRPCR產物直接測序法：產物直接測序法：1-61-

16、6型及亞型型及亞型1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a,1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a,6b,6k6b,6kHCVHCV基因分型基因分型34 肝 炎肝 炎 分 子 診 斷 綜 合 檢 查 申 請 單分 子 診 斷 綜 合 檢 查 申 請 單 姓名 必填 性別（必填） 男 / 女 年齡 必填 門診號 科別 住院號 病房 床號 送檢醫(yī)院 送檢醫(yī)生 必填 醫(yī)生聯系電話 必填 采集時間（必填） 年 月 日 時 送檢時間（必填） 年 月 日 時 臨床印象：臨床印象： 乙肝 丙肝 混合性肝炎 肝硬化 肝癌 肝纖維化 現病

17、史現病史（臨床表現以及病程） 抗病毒藥物使用情況： 拉米夫定(賀普丁)_ 年 月至_ 年 月 阿德福韋(賀維力)_ 年 月至_ 年 月 恩替卡韋_ 年 月至_ 年 月 替比夫定_ 年 月至_ 年 月 替諾福韋_年 月至_ 年 月 干擾素_ 年 月至_ 年 月 恩曲他濱_年 月至_ 年 月 檢測項目（注意：請在要檢測的項目前打“檢測項目（注意：請在要檢測的項目前打“”確認”確認 ） 核苷類似藥藥物敏感性核苷類似藥藥物敏感性 HBV P 區(qū)耐藥檢測 拉米夫定耐藥檢測 阿德福韋酯耐藥檢測 e e 抗原陰性抗原陰性 HBV 前 C 區(qū)和 C 區(qū)變異檢測 HBV 前 C 區(qū) 1896 位點檢測(熒光定量

18、 PCR 法) HBVC 區(qū) 1762/1764 位點檢測(熒光定量 PCR 法) 預后及動態(tài)監(jiān)測預后及動態(tài)監(jiān)測 高靈敏度 HBV-DNA（羅氏羅氏 COBASCOBAS：最低檢測下限最低檢測下限 12 12 IUIU，EDTAEDTA 抗凝血漿抗凝血漿 2ml2ml，適用于常規(guī)乙肝定量陰性的患者） HBV 基因分型(測序法：8 個基因型) HBV 基因分型(熒光 PCR 法：2 個基因型) HBV 前 S 區(qū)和 S 區(qū)變異檢測 HCV 基因分型(測序法：6 個基因型及其亞型) HCV 基因分型(熒光 PCR 法：1a、1b、2a、2b、2c、3a) 其他肝炎病毒核酸檢測(熒光定量 PCR 法) 標本類型標本類型（必填）（必填） 血清 EDTA 抗凝血漿（紫頭管） 糞便（HAV、HEV 核酸檢測） 備注備注 1、采集血清(漿)量 2ml，抗凝血標本請將血漿分離后送檢，