重組梅毒螺旋體抗原的研究進展

1、重組梅毒螺旋體抗原的研究進展    摘要nbsp;在梅毒螺旋體人工培養(yǎng)尚未獲得成功的情況下，基因克?。碊NA重組）技術的出現(xiàn)為該病原的研究開辟了一條新的途徑。應用基因工程技術目前已制備出多種重組梅毒螺旋體抗原，這些抗原的制備對梅毒發(fā)病機理的探討、疫苗的研制、以及血清學診斷試驗的建     尹躍平  國外醫(yī)學皮膚性病學分冊1999年第25卷第6期 摘要 在梅毒螺旋體人工培養(yǎng)尚未獲得成功的情況下，基因克?。碊NA重組）技術的出現(xiàn)為該病原的研究開辟了一條新的途徑。應用基因工程技術目前已制備出多種重組梅毒螺旋

2、體抗原，這些抗原的制備對梅毒發(fā)病機理的探討、疫苗的研制、以及血清學診斷試驗的建立與應用具有重要意義，為梅毒的預防和控制提供了更加有效的手段。 一、概況 梅毒是一種臨床表現(xiàn)極為復雜，幾乎可累及全身各器官的性病。盡管本世紀40代年發(fā)現(xiàn)了治療梅毒的理想藥物青霉素，但目前該病在全球仍然是一項重要的公共衛(wèi)生問題1。目前尚未解決梅毒的病原體梅毒螺旋體（Treponema pallidum,TP）的人工培養(yǎng)問題，從而阻礙了對TP致病機理探討、疫苗研制、以及梅毒血清學診斷技術開發(fā)等方面的深入研究。80年代初，隨著分子生物學技術的發(fā)展，特別是基因工程（DNA重組）技術的出現(xiàn)使梅毒螺旋體的研究進入一個新的階段2，

3、目前，TP的全部基因組DNA序列已經被解析1。通過重組TP dNA的克隆以及在大腸桿菌中的表達，制備出多種重組TP抗原，為梅毒的研究提供了一條新的途徑?，F(xiàn)就近10年來有關重組TP抗原的研究現(xiàn)況進行復習。 二、重組TP抗原的特性及制備 目前已重組的TP抗原有近20多種，如TpN15、TpN17、TpN19、TpN2935（TpD）、TpN44.5（TmP a）、TpN47、TpN35(Tmp c)等3?，F(xiàn)將其中部分有應用前景的重組TP抗原分述如下。 （一）TP15kD抗原4：15kD蛋白是一種脂蛋白，首先由Hensel等1985年分離鑒定，它在TP膜蛋白中的含量相對較少，但在免疫印跡試驗中與人梅

4、毒血清間顯示了超強的反應性，同時對實驗梅毒兔的淋巴細胞有很強的增生反應，表明15kD蛋白不僅具有較強的體液免疫原性，而且有較強的細胞免疫原性，但Centurion-Lara等5實驗表明，此蛋白對TP感染沒有任何免疫保護性。重組15kD抗原基因由Norgard等用特異的單克隆抗體從TP基因庫中篩選得到4。其最新報道的表達質粒為pMALc25，該質粒在DNA插入位點的上游含有麥芽糖結合蛋白基因，使表達的融合蛋白易于分離和提純。 （二）4D抗原：4D抗原是分子量分19kD的一種TP外膜蛋白，Radolf等6研究發(fā)現(xiàn)無論是自然狀態(tài)還是重組4D蛋白都由二巰鍵交叉相聯(lián)成寡聚結構，且耐蛋白酶，表明4D抗原可

5、能在TP外膜保持完整結構中起著非常重要的作用。重組TP4D抗原首先由Feniger等在E coli RRI大腸桿菌中表達和分離提純7。Borenstein等用肌注和靜脈注射的方法探討了重組TP 4D抗原對實驗性梅青的影響，顯示以4D抗原免疫動物后能夠改變實驗梅毒的病程，表明4D抗原免疫實驗動物后，可對感染梅毒產生部分保護的作用。提示重組TP抗原是制備疫苗的又一可能途徑。 （三）TP24 kD抗原：此重組蛋白是以質粒pUC8為載體在大腸桿菌中表達的一種分泌蛋白8，具有很強的免疫原性，其編碼TP24kD抗原的DNA序列僅存在于致病性的TP基因中，而非致病性TP中不存在此DNA序列，提示TP24kD

6、抗原與TP的致病性相關，但與TP致病性的關系有待進一步研究。Hsu等人的實驗發(fā)現(xiàn)，重現(xiàn)24kD的表達可以改變大腸桿菌的生長形態(tài)，出現(xiàn)與一般大腸桿菌不一樣的扁平粗糙的菌落和絲狀樣生長，表明24KD抗原與TP的生長特性相關。 （四）TmP A和TmP B：TmP a是一個分子量為42kD的TP膜蛋白。Schouls9等構建了能在大腸桿菌K-12中大量表達該重組蛋白的質粒載體pPLc245。Ijsselmuiden等10用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法探討了重組TmPA抗原在血清學診斷中的意義，通過對148例未治療和167例已治療的梅毒血清以及190例非梅毒血清進行了檢測，其敏感性分別為：一期

7、梅毒76%、二期梅毒100%、早期穩(wěn)性梅毒98%，在治療后1年以內的梅毒患者中，其抗TmP a的滴度明顯下降，這表明TmP a不僅在梅毒血清診斷中有意義，而且可望用于梅毒治療效果的監(jiān)測。TmP b基因位于TmP A基因下游9。Schouls等人的實驗表明，抗TmP b抗體渡度隨著梅毒患者的治療呈下降趨勢，因而可望用于梅毒治療的監(jiān)測。但單獨用Tmp b抗原不適宜作血清學診斷，因為梅毒患者血清的很大一部分對Tmp B不起反應。Wicher等11用重組TP抗原對豚鼠進行免疫，結果發(fā)現(xiàn)，重組TP抗原中只有TmP B可以改變梅毒的病程，提示重組TmP b抗原在疫苗制備中可能有一定的意義。 （五）TP47

8、kD抗原：該蛋白為TP整合性膜蛋白抗原，1986年Norgard等12在大腸桿菌中首先克隆及表達了重組47kD抗原。多中心研究發(fā)現(xiàn)13，此蛋白有很強的免疫原性，在TP中含量非常豐富，且為致病菌特有的蛋白。Chamberlain等12采用含有依賴T7 RNA多聚酶的表達載體，建立了高效表達重組47kD的系統(tǒng)，并對此重組抗原與自TP中分離得到的自然47kD蛋白進行了生物學分析與比較，結果表明這兩種來源的47kD抗原其生物學特性相同，均為含蛋白脂質，其疏水性可能與致病性有關。為了探討疏水性結構與抗原性的關系，Weigel等14表達了非?；挠H水性重組47kD抗原，通過免疫印跡試驗對116例不同期的梅

9、毒血清進行檢測，表明親水性重組47kD抗原的抗原性保持不變，說明?；Y構與抗原性無關。 除了上述蛋白抗原外尚有多種具有較強抗原性的TP重組抗原，如Tromp2(28kD)15，TmPC(35kD)及34kD抗原等。這些重組抗原的生物學及免疫學特性等有待進一步探討。 三、重組TP抗原在血清學診斷中的應用 盡管Fujimura等16用ELISA檢測了不同重組抗原的免疫反應性，發(fā)現(xiàn)G17的反應性比M47、S42和G15都高。但近年來的應用研究趨向于將2種或2種以上的重組抗原聯(lián)合使用，綜合兩種或多種抗原的不同特性，從而使其具有更高的特異性和敏感性。 （一）15kD與47 kD組合17：目前認為15 k

10、D和47 kD是兩種抗原性最強的TP蛋白，Zrein等對以重組15 kD和47 kD為抗原的酶免疫試劑盒ELISyph-rG的敏感性和特異性進行了評價。在TPHA檢測陽性的血清中，其ELISyph-rG結果和TPHA抗體滴度之間的相關性為0.94。在對VDRL方法檢測為陰性的1822份正常健康自愿者血清（其中440份血清用TPHA檢測為陰性）檢測后，結果在這1822份血清中用ELISyph-rG法檢測出4份陽性血清。用FTA-ABS和WB法對陽性血清進行進一步確證發(fā)現(xiàn)，其敏感性達100%，特異性大于99.8%，認為以重組15 kD和47 kD為抗原的ELISyph-rG法可代替VDRL和TPH

11、A法，適合用于大樣本的篩檢。 （二）15 kD、17 kD、47 kD組：此3種TP抗原存于梅毒的整個病程中18，包括晚期穩(wěn)性梅毒。尤其對于伴有HIV感染的梅毒患者在抗TP的含量低于一般梅毒患者的情況下亦能檢測到抗47 kD抗體。Gerber等3人對3種重組抗原的聯(lián)合應用進行了研究，結果表明18例梅毒患者中，17例患者在整個病程中均可檢測到抗體，而42例正常人血清中無1例抗體陽性，提示這種檢測方法有很高的敏感性和特異性。Young等18對這3種重組蛋白為抗原的酶免疫試劑盒ICE syphilis(immune-capture EIA)進行了評價，并與自然TP為抗原的試劑盒Captia Sele

12、ctSyph-G、TPHA、FTA-ABS及VDRL進行了比較，結果顯示ICE Syphilis的特異性明顯高于Captia selectSyph-G(分別為99.8%與99.2%，P0.02，其敏感性也明顯高于Captia selectSyph-G、FTA-ABS及TPHA（分別為99%100%，P0.01，91.4%92.4%，92.4%和97.1%。在15例伴HIV感染的梅毒患者中，血清ICE syphilis檢測結果均為陽性，而Captia selectSyph-G檢測結果出現(xiàn)3例陰性。由此可見，ICE syphilis 檢測方法的高特異性及高敏感性將為梅毒的篩檢測提供一種理想的手段。

13、 young等還建立了應用這3種重組蛋白為抗原的快速檢測梅毒的膠乳凝集方法Syphilis fast 19，并通過檢測1518份隨機血清標本，對Captia selectSyph-G和VDRL的特異性進行了比較，以及在99份各期梅毒血清和15例篩檢陽性的血清中對其敏感性進行了評價，其特異性（99.8%）明顯高于Captia SelectSyyph-G（99.2%）和VDRL（99.1%）（P0.02，但其敏感性與Captia selectSyph-G間沒顯著性差異（分別為93%和92.1%），但這兩種方法的敏感性均顯著高于VDRL（46.5%）(P0.001)。由此可見，Syphilis fa

14、st法可望成為一種特異性高、檢測速度快、操作簡便的梅毒篩檢方法。 四、展望 farley 等20認為，對有關人群進行梅毒篩檢是控制和預防梅毒的重要措施之一。目前常規(guī)用于梅毒篩檢和診斷的血清學試驗主要有兩種，一種是對脂類抗原的非螺旋體試驗方法（如VDRL、RPR），另一種是特異性梅毒螺旋體試驗（如TPHA、FTA-ABS）。前者敏感性和特異性不高，存在著假陽性和假陰性，而后者最大的問題是抗原來源的缺乏，尚未得到解決。因為TP目前還不能人工培養(yǎng)，其用于診斷試驗的TP主要通過兔睪丸接種獲得，這既需要一定的實驗室條件，又費時、費力、費材料。因此探討重組TP抗原的梅毒血清學診斷中的應用是制備重組抗原的主

15、要目的之一，重組蛋白的制備使我們能夠在實驗室里得到不同目的抗原，這一方面為建立現(xiàn)有梅毒血清學診斷的替代方法提供了條件，同時又為建立特異性和敏感性更高的診斷新方法奠定了基礎，如通過重組抗原制備單克隆抗體，以建立檢測梅毒抗原的方法，將為神經梅毒、早期隱性梅毒的實驗室診斷提供新的手段。同時通過對不同重組抗原的結構，以及生物學和免疫學的分析，可以達到篩選TP致病因子和開發(fā)TP疫苗的目的，為TP的預防和治療提供更加有效的手段。 參考文獻 1Fraser gM et al. Science ,1998;281(17):375-388 2.Walfifld aM et al. Science ,1982;2

16、16(30):522-523 3. gerber A et al. Immunobiology ,1996;196(5):535-549 4.Purcell bK et al. Infect Immun,1989;57:3708-3414 5.Centurion-Lara A et al. Infect immun,1997;65(4):1440-1444 6.Radolf JD et al. J Bacteriol,1987;169(4):1365-1371 7. Borenstein LA et al.J Immunol,1988;140:2415-2421 8. Hsu PL et al

17、. Infect Immun,1988;56:1135-1143 9.Schouls LM et al. Infect Immun,1989;57:2612-2623 10. Ijsselmuiden OE et al. J Clin microbiol,1989;27(1):152-157 11. Wicher K et al. Infect Immun,1991;59:4343-4348 12. Chamberlain NR et al. Infeet Immun,1988;56:71-78 13. Chamberlain NR et al. Infect immun,1989;57:2878-2885 14.Weigel LM et al. Infect Immun,1992;60:1568-1576 15.Champion CI et al.J Bacteriol,1997;179:1230-1238