糞菌移植對潰瘍性結腸炎腸粘膜屏障的保護ppt課件

1、 糞菌移植對潰瘍性結腸糞菌移植對潰瘍性結腸炎腸粘膜屏障的保護炎腸粘膜屏障的保護 導導 師：武師：武 華華 學學 生：程鞏生：程鞏選題依據(jù)選題依據(jù)1國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新2研究方案研究方案3研究計劃及預算研究計劃及預算4選選 題題 依依 據(jù)據(jù) 糞菌移植 炎癥性腸病 腸粘膜屏障糞菌移植 糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是將健康人糞便中的功能菌群移植到菌群分布異常的患者胃腸道內(nèi)，重建其健康的菌群分布結構，實現(xiàn)腸道及腸道外疾病恢復的一種治療方式。在世界醫(yī)學史上至少始于公元4世紀，但是直到近幾年才得到了恢復的一種治療方式。FMT在現(xiàn)代

2、醫(yī)學中的概念包括4個層面的含義：(1)從健康捐贈者糞便中分離功能菌群；(2)移植到患者消化道；(3)重建患者腸道菌群狀態(tài)；(4)目的在于治療腸內(nèi)外疾病。炎癥性腸病炎癥性腸病 炎癥性腸病炎癥性腸病inflammatory bowel diseases inflammatory bowel diseases IBD IBD 是一組病因未明的累及胃腸道的慢性炎癥性是一組病因未明的累及胃腸道的慢性炎癥性疾病包括潰瘍性結腸炎疾病包括潰瘍性結腸炎ulcerative colitis UCulcerative colitis UC和克羅恩病和克羅恩病Crohns diseasesCDCrohns disea

3、sesCD。近年來發(fā)病率。近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢呈逐年上升趨勢 其病因和發(fā)病機制尚不明確，與其病因和發(fā)病機制尚不明確，與遺傳環(huán)境微生物免疫等多種因素密切相關。遺傳環(huán)境微生物免疫等多種因素密切相關。腸粘膜屏障 腸黏膜是機體中一處最大的黏膜表面,它不但是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要場所，同時也是人體最大的細菌儲存器官和病原微生物、毒素侵入機體的主要門戶。腸黏膜屏障是指由機械屏障、生物屏障、免疫屏障等組成的一個復雜而又龐大的立體防御體系，其主要作用是能夠有效地阻止腸道內(nèi)的有害物質(zhì)如細菌和毒素穿過腸粘膜進入人體內(nèi)其他組織、器官和血液循環(huán)，使機體內(nèi)環(huán)境保持相對穩(wěn)定, 維持機體的正常生命活動。 當各種原因引

4、起腸黏膜損傷、萎縮、腸道通透性增加或腸道菌群失調(diào)時，就容易導致腸道細菌易位和(或)腸源性內(nèi)毒素血癥，從而誘發(fā)或加重全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)或引起多器官功能衰竭(multiple organ failure, MOF) 形成惡性循環(huán)。近期的研究表明：炎性腸病IBD病人腸黏膜對腸道內(nèi)共生菌群不恰當?shù)拿庖叻磻菍е录膊“l(fā)生發(fā)展的重要原因之一。盡管還沒有確定哪一種菌對腸黏膜免疫屏障有影響，但目前的研究發(fā)現(xiàn)IBD病人腸道內(nèi)菌群的數(shù)量和豐度都較正常人低國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新之處國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新之處近年來FMT在治療復

5、發(fā)性腸道艱難梭狀芽孢桿菌感染中取得了很好的療效。因此，國外相繼開始采用該方法治療IBD。 但糞菌移植治療炎癥性腸病的研究目前正處于起步階段，尚需逐步開展針對糞菌移植治療對照研究提供更有力的依據(jù)，因此開展糞菌移植在治療炎癥性腸病中應用的研究具有深遠的現(xiàn)實意義。本課題旨在評價糞菌移植對炎癥性腸病大鼠血清DAO及D-乳酸影響，研究其對大鼠腸粘膜屏障的保護作用。從而為進一步臨床應用提供依據(jù)。國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新之處國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新之處 現(xiàn)階段，F(xiàn)MT研究大部分是關于FMT治療復發(fā)性CDI和IBD的個案或系列病例報道,但FMT導致患者腸道菌群具體發(fā)生何種有益變化及其潛在的機制仍不完全清楚。本實驗在于

6、研究糞菌移植對潰瘍性結腸炎大鼠腸粘膜屏障的保護作用，此項研究目前鮮有報道。實驗分組實驗分組建立模型建立模型干預措施干預措施預期成果預期成果技術路線技術路線實驗分組實驗分組 健康雄性SD大鼠54只，體重250300g，隨機分為3組： （A空白對照組 （B模型生理鹽水組 （C模型糞菌移植組建立模型建立模型 大鼠造模前1 d禁食24 h，不禁水，稱重后，3的戊巴比妥腹腔注射麻醉(或乙醚)，52，4，6三硝基苯磺酸(TNBS WV)按100 mgkg一150 mgkg(約等于TNBS原液O4mL06 mL相當于200 g大鼠20 mg30 mg)；分別加入乙醇；體位為頭朝下，用聚丙烯管插入肛門上段8

7、cm，注射器注人。再倒立15 min左右，以防藥液溢出，UC一次性灌腸。 新鮮糞菌液制備流程：將供體新鮮糞便樣本置于攪拌器中，09NaCl溶液進行初步均質(zhì)加工新鮮糞便與09NaCl溶液的比值為1:5）；將糞便漿體經(jīng)不銹鋼濾網(wǎng)過濾去除其中的大顆粒物質(zhì)；冰上轉運至實驗室并在采集后2h內(nèi)進行處理；將樣本在氮氣生物工程廚內(nèi)進行稱重并在勻漿器中進一步勻質(zhì)處理；漿體逐級經(jīng)過直徑20mm、10 mm、05mm和025mm的不銹鋼濾網(wǎng)過濾以去除未吸收的食物殘渣和小顆粒物質(zhì)；將再次過濾的樣本以6000轉min的速率離心15min，并將沉淀再懸浮于09NaCl溶液中，得幾乎無色無味的糞菌液。獲得的新鮮糞菌液可立即

8、進行移植，也可加入無菌甘油后置于一80作為冰凍樣本保存18周。干預措施干預措施 三組大鼠按大鼠正常灌腸劑量灌入糞菌移植液及生理鹽水。A、B組給生理鹽水灌腸；C組給予糞菌移植液。飼養(yǎng)期間,于第3、7、11天3個時間點每組分別取5只大鼠取血測量相關指標，并取肛門以上8cm腸段卷起，置10中性甲醛中固定，石蠟包埋、切片、HE染色后顯微鏡下觀察。在光鏡下觀察組織損傷程度并采用Chiu氏6級評分法評估損傷程度檢測指標及意義檢測指標及意義D-乳酸乳酸 D-乳酸是腸道固有細菌的代謝終乳酸是腸道固有細菌的代謝終產(chǎn)物，幾乎哺乳動物機體的各種組織均不產(chǎn)物，幾乎哺乳動物機體的各種組織均不產(chǎn)生產(chǎn)生D-乳酸，也沒有代謝

9、分解乳酸，也沒有代謝分解D-乳酸的酶乳酸的酶系統(tǒng)，所以血漿中的系統(tǒng)，所以血漿中的D-乳酸基本上來源于乳酸基本上來源于腸道。當腸道發(fā)生急性缺血時，局部細菌腸道。當腸道發(fā)生急性缺血時，局部細菌大量增殖，破壞了腸粘膜的生物屏障，由大量增殖，破壞了腸粘膜的生物屏障，由于腸缺血致腸粘膜絨毛頂端上皮脫落，細于腸缺血致腸粘膜絨毛頂端上皮脫落，細胞旁路途徑增加而致腸粘膜通透性增加，胞旁路途徑增加而致腸粘膜通透性增加，此時腸道中細菌產(chǎn)生的大量此時腸道中細菌產(chǎn)生的大量D-乳酸通過受乳酸通過受損粘膜經(jīng)循環(huán)入血，故監(jiān)測血中損粘膜經(jīng)循環(huán)入血，故監(jiān)測血中D-乳酸水乳酸水平可及時反映腸粘膜損害程度和通透性變平可及時反映腸粘

10、膜損害程度和通透性變化?；?。檢測指標及意義檢測指標及意義血漿二胺氧化酶血漿二胺氧化酶diamine oxidase，DAO活活性測定性測定 DAO是腸粘膜細胞的標志物，存在于哺乳是腸粘膜細胞的標志物，存在于哺乳動物小腸絨毛上層，在其他組織和細胞中幾乎不動物小腸絨毛上層，在其他組織和細胞中幾乎不存在，生理狀況下血漿中存在，生理狀況下血漿中DAO活性很低，在腸粘活性很低，在腸粘膜受損時，由腸粘膜細胞釋放的膜受損時，由腸粘膜細胞釋放的DAO大量入血，大量入血，使血中濃度大幅度上升。有研究證實，血漿使血中濃度大幅度上升。有研究證實，血漿DAO活性升高的時相早于內(nèi)毒素和活性升高的時相早于內(nèi)毒素和D-乳酸

11、，提示血漿乳酸，提示血漿DAO活性作為反映腸屏障功能損傷指標不僅特異活性作為反映腸屏障功能損傷指標不僅特異度強，靈敏度也較高，且檢測方法簡便、費用低度強，靈敏度也較高，且檢測方法簡便、費用低，是反映腸粘膜結構完整性較理想的指標。，是反映腸粘膜結構完整性較理想的指標。檢測指標及意義檢測指標及意義 HE HE染色后光鏡觀察組織病理改變。染色后光鏡觀察組織病理改變。雄性雄性SD大鼠模型大鼠模型空白對照組空白對照組糞菌移植組糞菌移植組于于3、7、11天各處死天各處死6只大鼠只大鼠測血清指標濃度取結腸組織測血清指標濃度取結腸組織HE染色后光鏡觀察染色后光鏡觀察數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析統(tǒng)計軟件

12、分析技技 術術 路路 線線生理鹽水組生理鹽水組統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學分析 采用Spss13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，各組實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)標準差表示，血清學指標比較采用單因素方差分析，P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。預期成果預期成果 給予生理鹽水保留灌腸的潰瘍性結給予生理鹽水保留灌腸的潰瘍性結腸炎大鼠與給予糞菌水保留灌腸的潰腸炎大鼠與給予糞菌水保留灌腸的潰瘍性結腸炎大鼠相比，血清瘍性結腸炎大鼠相比，血清DAO及及D-乳酸檢測值增大，說明糞便菌群移植乳酸檢測值增大，說明糞便菌群移植對于潰瘍性結腸炎大鼠的腸黏膜屏障對于潰瘍性結腸炎大鼠的腸黏膜屏障具有保護作用。具有保護作用。 給予糞菌水保留灌腸的潰瘍性結腸炎給

13、予糞菌水保留灌腸的潰瘍性結腸炎大鼠與給予生理鹽水保留灌腸的潰瘍大鼠與給予生理鹽水保留灌腸的潰瘍性結腸炎大鼠相比，炎癥性腸病病理性結腸炎大鼠相比，炎癥性腸病病理下觀察損傷較輕。下觀察損傷較輕。 研究計劃研究計劃2014.08-2015.03課題調(diào)研，文獻檢索，做好綜述2015.03-2015.7進行動物飼養(yǎng)，做好預實驗；收集實驗數(shù)據(jù),完成實驗2015.7-2016.03總結實驗結果，進行統(tǒng)計分析撰寫并發(fā)表論文研究基礎研究基礎v 與本課題有關的，前期研究工作積累和已取得的研究工作成績v已參閱大量與課題相關的中英文文獻及與本課題參考性較強的相關研究資料和理論。v導師武華教授有深厚的學術造詣和豐富的臨

14、床經(jīng)驗以及實驗室實踐能力，可為實驗提供理論技術指導。v已基本掌握動物飼養(yǎng)、免疫組化等試驗操作的基本要領。 研究基礎研究基礎 已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況） 山西醫(yī)科大學中心實驗室擁有進行細胞培養(yǎng)和分子生物學實驗的設備和技術力量，包括熒光及倒置顯微鏡、醫(yī)學圖象處理系統(tǒng)和低溫冰箱等主要儀器設備，同時可利用生理實驗室及相關科室的儀器設備。實驗所需的相關的分子生物學試劑和免疫組化試劑均可從基因工程公司和試劑公司購買。動物中心實驗室有飼養(yǎng)動物的動物房和飼養(yǎng)條件。 分子免疫實驗室和動物中心的指導老師有豐富的理論實驗技術和操作經(jīng)驗，可

15、為實驗提供操作理論技術指導。經(jīng)費預算經(jīng)費預算支出科目金額|（萬元）計算根據(jù)及理由合計0.70科研業(yè)務費0.25文獻檢索費、復印、學術交流、開題等實驗材料費0.40進行動物飼養(yǎng)，做好預實驗；收集實驗數(shù)據(jù),完成實驗儀器設備費0.50流式細胞儀等參考文獻參考文獻1.Harrison OJ Maloy KJ. Innate immun eactivation inintestinal homeostasis. J Innate Immun，2019，3:585-5932.McGuckinMA，Eri R，Simms LA，etal.Intestinal barrier dysfunction In i

16、nflammatory bowel diseases Inflamm Bowel Dis，2021，5:100-1133.Lewis K, Caldwell J, Phan V, Prescott D, Nazli A, Wang A, Soderhlm JD, Perdue MH, Sherman PM, McKay DM. Decreased epithelial barrier function evoked by exposure to metabolic stress and nonpathogenic E. coli is enhanced by TNF-alpha. Am J P

17、hysiol Gastrointest Liver Physiol 2019; 294: G669-G6784.Laukoetter MG,NavaP，Nusrat A Roleof the intestinal barrier in inflammatory bowel disease World J Gastroenterol，2019，14:401-4075.李悅，武華，復合膳食纖維對炎癥性腸病大鼠腸黏膜屏障的保護作用 J 中國醫(yī)藥導報 2019年5月第7卷第13期6.Xavier RJ, Podolsky DK. Unravelling the pathogenesis of infl

18、ammatory bowel disease J. Nature,2019,448(7152):427-434參考文獻參考文獻7.Nagalingam NA, Lynch SV. Role of the microbiota in inflammatory bowel diseasesJ. Inflamm Bowel Dis, 2019, 18(5):968-984.8.DuPont AW, DuPont HL. The intestinal microbiota and chronic disorders of the gutJ. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2019, 8(9):523-531.9.Gough E, Shaikh H, Manges AR. Systematic review of intestinal microbiota transplantation (fecal bacterio therapy) for recurrent Clostridium difficile infectionJ. Clin Infec Dis, 2019,53(10):994-1002.10.Borody TJ, Khoruts A. Fecal microbiota transplantation and emerging a