熒光光度法測(cè)定榕樹(shù)葉總黃酮含量的研究

1、熒光光度法測(cè)定榕樹(shù)葉總黃酮含量的研究              作者：黃鎖義，龍鳳，梁宇，韋國(guó)鋒【關(guān)鍵詞】  熒光光度法；榕樹(shù)葉；總黃酮；測(cè)定摘要：目的根據(jù)黃酮類(lèi)化合物能與 Al3+ 形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物,建立一種測(cè)定榕樹(shù)葉總黃酮的新方法。方法用60%乙醇加熱回流提取榕樹(shù)葉有效成分，以蘆丁為標(biāo)樣,采用熒光分光度法，在波長(zhǎng) =460 nm下，測(cè)定榕樹(shù)葉中總黃酮含量，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果線性范圍在 020 gml1 之間，線性回歸方程:Y=0.45

2、0 0X+17.533 3 ，相關(guān)系數(shù)r=0.997 6 ，平均回收率99.8%100.3% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)=1.04% 。結(jié)論該法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,具有良好的分析應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：熒光光度法；  榕樹(shù)葉；  總黃酮；  測(cè)定Determination of Total Flavanoid in Leaves of Banyan by SpectrofluorimetryAbstract：ObjectiveOn the basis of reaction of total flavanoid with alumimum ion to form 

3、; fluorescent material，the new method of determining total flavanoid in leaves of banyan was  established.MethodsUsing 60% ethanol by continuous themral reflux to extract the banyan leaves,taking rutin as standard sample, selecting wavelength 460 nm with   spectrofluorophotometer,dete

4、rmining content of total flavanoid,then inspect the accuracy by  recovery test.ResultsThe range of linearity with concentration of rutin  was between 020 gml1，linearity relationship Y=0.450 0X+17.533 3,correlativity was 0.997 6，average rate of recovery was 99.8%100.3%, RSD  was 1.04%.

5、ConclusionThe method was simple ,rapid ,accurate and has bright future on   analysis application.Key words：Spectrofluorimetry；  Leaves of banyan；  Total  flavanoid；  Determination   黃酮類(lèi)（flavontes）化合物是植物光合作用產(chǎn)生的一大類(lèi)天然產(chǎn)物，已知的此類(lèi)化合物約有2 000多種，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分。在自然界

6、中最常見(jiàn)的是黃酮和黃酮醇，其它包括雙氫黃（醇）、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮類(lèi)等。天然來(lái)源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能通過(guò)血腦屏障，能進(jìn)入脂肪組織，進(jìn)而體現(xiàn)出如下功能：消除疲勞、保護(hù)血管、防動(dòng)脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大腦及其他臟器細(xì)胞的功能。黃酮類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗氧化抗衰老、抗輻射等作用15。近年來(lái)，世界上掀起了植物藥開(kāi)發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點(diǎn)倍受青睞，而黃酮類(lèi)化合物以其廣譜的藥理作用引人矚目。榕樹(shù)（Banyan），是?？崎艑贌o(wú)花果類(lèi)植物，全

7、世界有800多種，主要分布在熱帶亞熱帶地區(qū)。我國(guó)榕屬植物約100種，是熱帶雨林中的關(guān)鍵種類(lèi)。榕樹(shù)葉，性涼，主治感冒、風(fēng)熱、腸炎、痢疾、百日咳、咽喉腫痛、濕疹、痔瘡及麻疹不透6。研究表明7，黃酮類(lèi)化合物是榕樹(shù)葉的主要有效成分之一，具有多種生物活性。榕樹(shù)葉含三萜苷、黃酮苷、酸性樹(shù)脂、鞣質(zhì)、多酚類(lèi)等，其中黃酮類(lèi)和內(nèi)酯類(lèi)等有效成分對(duì)治療冠心病、老年性癡呆、腦血栓、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和消除自由基、抑菌、抗癌等方面有顯著效果，無(wú)毒副作用，并以此開(kāi)發(fā)出多種藥品和保健食品。目前對(duì)銀杏類(lèi)黃酮的研究較多，但對(duì)于榕樹(shù)葉黃酮類(lèi)化合物的研究還相對(duì)缺乏7。近年來(lái)，有關(guān)榕樹(shù)葉總黃酮含量的檢測(cè)采用紫外分光光度(UV)法7，紫外分光

8、光度(UV)法的實(shí)驗(yàn)原理是根據(jù)黃酮類(lèi)物質(zhì)與鋁離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，并產(chǎn)生特征吸收光譜而進(jìn)行測(cè)定。該方法雖然操作簡(jiǎn)便，成本低，但是，由于榕樹(shù)葉中成分復(fù)雜，富含多種酚類(lèi)物質(zhì)，對(duì)吸光值產(chǎn)生干擾，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性8。因此，為了尋求操作簡(jiǎn)便、成本低、更加準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，本文根據(jù)黃酮類(lèi)化合物能與鋁離子形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物，提出采用熒光光度法測(cè)定總黃酮的含量。1  材料與設(shè)備960MC型熒光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），SHBIII型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），F(xiàn)A 1104型電子天平（上海天平儀器廠），索氏提取器，蘆丁對(duì)照品（中國(guó)生物制品檢定所），榕樹(shù)葉（小葉榕），2

9、00505采自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院院內(nèi)，經(jīng)100烘干12 h，粉碎，備用；其他試劑均為分析純。2  原理和方法2.1  原理  紫外分光光度(UV)法的原理是根據(jù)黃酮類(lèi)物質(zhì)與鋁離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，并產(chǎn)生特征吸收光譜而進(jìn)行測(cè)定。由于榕樹(shù)葉中天然成分復(fù)雜，含有多種酚類(lèi)化合物，可與鋁離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成干擾,使測(cè)定結(jié)果偏高。為此，本文根據(jù)黃酮類(lèi)化合物能與鋁離子形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物，提出采用熒光分析法測(cè)定榕樹(shù)葉總黃酮含量，并進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)及回收實(shí)驗(yàn)證明實(shí)驗(yàn)原理。2.2  方法精密稱取榕樹(shù)葉樣品0.500 0 g，置索氏提取器中，適量石油醚加熱回流30 min

10、，棄去石油醚提取液，并于溫水浴中揮干殘留的石油醚。然后加50 ml 60%的乙醇加熱回流提取1 h，過(guò)濾，用60%乙醇定容至100 ml。吸取樣品溶液0.5 ml，置于10 ml容量瓶中,加入5%的AlCl3溶液3 ml，pH=4的醋酸-醋酸鈉緩沖液1 ml，用60%的乙醇定容，搖勻。精密稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，用60%的乙醇溶解，定容為100 ml，即配成濃度為100gml1的對(duì)照溶液。準(zhǔn)確吸取對(duì)照溶液0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 ml分別置于10 ml容量瓶中，加入5%的AlCl3溶液3 ml，pH=4的醋酸-醋酸鈉緩沖液1 ml，用60%的乙醇定容，搖勻，即配成蘆丁對(duì)照品

11、溶液。2.3  測(cè)定在波長(zhǎng)=460 nm條件下9，測(cè)定蘆丁對(duì)照工作溶液的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)相應(yīng)的濃度作圖，繪制工作曲線，然后在相同的條件下測(cè)定樣品中總黃酮的熒光強(qiáng)度，再用回歸方程求出含量。3  結(jié)果3.1  測(cè)定條件的選擇黃酮類(lèi)化合物與鋁離子可生成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物，本實(shí)驗(yàn)考察了AlCl3的用量。實(shí)驗(yàn)表明，用5%的AlCl3溶液加入13 ml為宜，本實(shí)驗(yàn)選擇AlCl3的加入量為3 ml。溶液的pH值影響絡(luò)合物的形成和熒光強(qiáng)度。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液呈酸性pH為46時(shí)，溶液熒光強(qiáng)度最大，所以，實(shí)驗(yàn)中選擇加入pH為4的醋酸醋酸鈉緩沖液1 ml。  

12、       醇溶劑是黃酮類(lèi)化合物最常用的提取溶劑,實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度的乙醇溶液對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%以上,溶液熒光強(qiáng)度變化較小,考慮到成本因素,我們選用60%的乙醇作溶劑。將溶液靜置于室內(nèi)避免陽(yáng)光直射并控制不同時(shí)間測(cè)定蘆丁對(duì)照品溶液的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶液熒光強(qiáng)度在50 min 內(nèi)略有增加,然后有平緩下降趨勢(shì)。所以,選擇靜置50 min 為最佳測(cè)定時(shí)間。實(shí)驗(yàn)了常見(jiàn)的金屬離子對(duì)測(cè)定的干擾。結(jié)果表明，加入100倍的K+ ，Ca2+ ，Mg2+   對(duì)黃酮的測(cè)定無(wú)影響，但100倍的

13、Fe3+   對(duì)測(cè)定的干擾很大。3.2  工作曲線   實(shí)驗(yàn)表明，在 020 gml1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為Y=0.450 0X+17.533 3，式中:Y表示熒光強(qiáng)度，x表示蘆丁的濃度(gml1)。相關(guān)系數(shù)r=0.997 6,說(shuō)明熒光強(qiáng)度與相應(yīng)的濃度線性顯著相關(guān)。3.3  樣品測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)  按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定了榕樹(shù)葉總黃酮的含量,并對(duì)樣品溶液進(jìn)行平行測(cè)定(n=5)。結(jié)果見(jiàn)表1。表1  榕樹(shù)葉中總黃酮含量及精密度測(cè)定含量（略）    為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在樣品溶液

14、中加入蘆丁對(duì)照品進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，熒光分析法測(cè)定榕樹(shù)葉中總黃酮含量的平均回收率在99.8%100.3%之間,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，說(shuō)明本方法可行。表2  樣品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）4  結(jié)論4.1  實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光光度法測(cè)定榕樹(shù)葉總黃酮的含量,方法靈敏度高,其準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、線性關(guān)系、穩(wěn)定性都很好，能達(dá)到科研和生產(chǎn)的要求，操作簡(jiǎn)便，可推廣用于植物中總黃酮的測(cè)定，具有良好的分析應(yīng)用前景。4.2  榕樹(shù)葉中富含多酚類(lèi)物質(zhì)，直接用硝酸鋁比色法測(cè)定總黃酮含量時(shí)，會(huì)使結(jié)果偏高。采用熒光光度法測(cè)定榕樹(shù)葉總黃酮含量，可排除一些常見(jiàn)金屬離

15、子的干擾，并考察了溶劑、pH、三氯化鋁用量、放置時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，進(jìn)一步提高了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。4.3  實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，榕樹(shù)葉中含有較為豐富的黃酮，榕樹(shù)分布廣泛。因此，榕樹(shù)葉具有廣泛的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值，值得綜合利用加強(qiáng)資源開(kāi)發(fā)。參考文獻(xiàn)1華光軍，郭  勇.黃酮類(lèi)化合物藥理研究進(jìn)展J.廣東藥學(xué)，1999，9（4）：9.2黃河勝，馬傳庚，陳志武.黃酮類(lèi)化合物藥理作用研究進(jìn)展J.中國(guó)中藥雜志，2000，25（10）：499.3王  瑋，王  琳. 黃酮類(lèi)化合物的研究進(jìn)展J.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，4（2）：115.4曹緯國(guó)，劉志勤，邵  云，等. 黃酮類(lèi)化合物藥理作用研究進(jìn)展J.西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（12）：2241. 5姜國(guó)芳，謝宗波，樂(lè)長(zhǎng)高.銀杏葉黃酮類(lèi)化合物的研究進(jìn)展J.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15