血漿蛋白質(zhì)的測(cè)定

1、第八章 血漿蛋白質(zhì)的測(cè)定第一節(jié) 概 述一、血漿蛋白質(zhì)的組成及功能血漿蛋白質(zhì)是血漿固體成份中含量最多、組成復(fù)雜、功能廣泛的一類(lèi)化合物。占血漿固體成份90%左右，目前已經(jīng)研究的血漿蛋白質(zhì)有300多種，分離出的純品約100來(lái)種，除免疫球蛋白外，主要由肝細(xì)胞合成，主要功能。1. 維持血漿膠體滲透壓；清蛋白。2. 作為某些物質(zhì)的載體，起運(yùn)輸作用；如清蛋白能與多種物質(zhì)結(jié)合（FA、膽紅素），某些球蛋白具特異地運(yùn)輸某些物質(zhì)的功能，運(yùn)鐵蛋白、運(yùn)皮質(zhì)醇蛋白。3. 維持體液pH恒定；血漿蛋白pI一般都小于7.4是弱酸，一部分以弱酸鹽形式存在，構(gòu)成緩沖對(duì)。4. 免疫功能；血漿中許多具有免疫功能的球蛋白，主要由漿細(xì)胞合

2、成，電泳時(shí)位于區(qū)帶，如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，此外，還有具有免疫作用的非特異球蛋白，如補(bǔ)體。5. 凝血與纖溶作用；凝血與纖溶是一對(duì)矛盾的統(tǒng)一、凝血因子與纖溶因子絕大部分是血漿蛋白質(zhì)，它們促進(jìn)血液凝固，防止血液流失和溶解血栓，防止重要臟器的動(dòng)脈栓塞。6. 營(yíng)養(yǎng)作用；血漿蛋白質(zhì)可分解成AA，用于合成組織蛋白或氧化供能。7. 催化作用；血漿中有許多酶類(lèi)，其中部分在血漿中發(fā)揮作用，稱(chēng)血漿功能性酶，如凝血酶原、纖溶酶原、銅藍(lán)蛋白、LPL、LCAT、腎素等。二、個(gè)別血漿蛋白質(zhì)（一）前白蛋白（prealbumin，PA）分子量5.4萬(wàn)，由肝細(xì)胞合成，電泳時(shí)移動(dòng)速度較白蛋白快，位于其前方面得名

3、，半壽期短12h，PA是一類(lèi)運(yùn)載蛋白，一種能與甲狀腺素結(jié)合，稱(chēng)為甲狀腺結(jié)合蛋白，一種能與VitA結(jié)合，稱(chēng)為VitA結(jié)合蛋白，常用測(cè)定方法是免疫學(xué)方法，正常參與范圍0.20.4g /L,急性炎癥，惡性腫瘤，肝硬化或腎炎時(shí)下降。（二）白蛋白（albumin，Alb）分子量66458，由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，半壽期1519天，是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，占40%60%，主要功能，維持血漿膠體滲透性，緩沖作用，運(yùn)輸作用，營(yíng)養(yǎng)作用，調(diào)節(jié)某些激素或藥物活性。白蛋白可微量地通過(guò)腎小球，約0.04%，但大部分被血小管重吸收。白蛋白的測(cè)定方法目前主要是溴甲酚綠（BCG）法，正常參考范圍3555g/L，血漿白蛋白增高臨床

4、少見(jiàn)，主要見(jiàn)于嚴(yán)重失水引起血液濃縮，血漿白蛋白降低臨床常見(jiàn)。合成障礙急；慢性肝炎。丟失過(guò)多；腎病綜合癥、慢性腎小球、腎炎、糖尿病、系統(tǒng)性斑狼瘡等。分解過(guò)多；營(yíng)養(yǎng)不良，慢性胃腸道疾病。（三）1-酸性糖蛋白（1-acid glycoprotein，AAG）、分子量約4萬(wàn)，含糖約45%，pI2.73.5，主要由肝細(xì)胞合成，某些腫瘤組織也可合成。AAG是主要的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，急性炎癥時(shí)上升，與免疫防御功能有關(guān)。AAG測(cè)定方法，使用AAG抗體，進(jìn)行免疫擴(kuò)散法或免疫比濁法檢測(cè)，正常參考范圍0.51.5g/L,主要作為急性時(shí)相反應(yīng)的指標(biāo)，風(fēng)濕病、惡性腫瘤、心肌梗塞患者上升，營(yíng)養(yǎng)不良、嚴(yán)重肝病下降。（四）1

5、-抗胰蛋白酶（1-antitrypsin，1AT或AAT），分子量5.5萬(wàn)，pI4.8，含糖10%12%，電泳時(shí)位于1區(qū)帶，占90%左右，由肝細(xì)胞合成，能抑制多種酶活性，尤其是蛋白酶，占血清中抑制蛋白酶活力的90%左右，抑制作用有明顯的pH依賴(lài)性，在中性和弱堿性中活力最大。AAT也是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，主要功能是對(duì)抗多形核白細(xì)胞吞噬作用時(shí)釋放的溶酶體蛋白水解酶。AAT測(cè)定方法，目前主要采用免疫化學(xué)法，正常參考范圍，新生兒血清1.452.7g/L，成人0.782.0g/L，AAT下降見(jiàn)于胎兒呼吸窘迫癥，AAT缺陷所致的肺氣腫、肝硬化等，AAT上升見(jiàn)于急性炎癥、外科手術(shù)后，長(zhǎng)期服用可的松藥物，妊

6、娠及服用避孕藥物。（五）甲胎蛋白（1-fetoprotein，AFP）分子量6.57萬(wàn)，pI4.75含糖量4%，主要由胎兒肝合成，妊娠1315周血清AFP含量最高，以后逐漸下降，出生時(shí)僅為高峰期的1%0.1%，周歲時(shí)接近成人水平，僅1030g /L，功能不詳。AFP作為腫瘤標(biāo)志物，對(duì)原發(fā)性肝Ca的診斷很有價(jià)值，80%以上原發(fā)性肝Ca患者血清AFP上升，但無(wú)特異性，肺Ca、胰腺Ca，肝硬化患者血清AFP亦升高，此外，羊水AFP含量測(cè)定可用于胎兒產(chǎn)前監(jiān)測(cè)，AFP提示胎兒畸形（神經(jīng)管缺損、脊柱裂、無(wú)腦兒），死胎。AFP測(cè)定方法，火箭電泳放射自顯影，放射免疫分析法，靈敏度特異性很高，有放射污染。反向間

7、接血凝法（RPHA），操作簡(jiǎn)便，定量不夠精細(xì)，適合于普查、篩選。酶聯(lián)免疫法（ELISA），靈敏度接近放免，且操作簡(jiǎn)便，無(wú)放射污染，便于推廣。（六）結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，Hp）又名觸珠蛋白，是一種糖蛋白，主要由肝合成，電泳時(shí)位于2區(qū)帶，是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，為兩對(duì)肽鏈組成的四聚體（22），鏈有1和2兩種，其中1有兩種遺傳變異體。Hp的主要功能與血漿中游離血紅蛋白結(jié)合，（不可逆結(jié)合），并送至肝細(xì)胞內(nèi)降解，因此Hp在溶血后含量急劇下降。血漿Hp測(cè)定方法，測(cè)定Hp-Hb復(fù)合物中過(guò)氧化物酶活性。在血漿中加入過(guò)量Hb，生成Hp-Hb復(fù)合物，凝膠層折法收復(fù)合物分離，測(cè)定結(jié)合的Hb。電泳法。免

8、疫分析法，正常參考范圍0.32.15g/L，個(gè)體間變異較大。急性時(shí)相反應(yīng)中血漿Hp上升，燒傷、腎病綜合征引起Alb丟失時(shí)Hp上升，血管內(nèi)溶血Hp下降。（七）2-巨球蛋白（2-macroglobulin，2MG或AMG） 是血漿中分子量最大的蛋白質(zhì)，分子量為62.580萬(wàn)，含糖量8%。AMG最突出的特性能與多種分子和離子結(jié)合，特別是它能與不少蛋白水解酶結(jié)合而影響這些酶的活性，有選擇地保護(hù)某些蛋白酶活性的作用。AMG由肝細(xì)胞與單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)合成，半壽期5天。AMG測(cè)定方法，免疫化學(xué)法，正常參考范圍1.254.10g /L，在低Alb血癥，AMG上升，妊娠、服用避孕藥時(shí)AMG上升。（八）銅藍(lán)蛋白（

9、ceruloplasmin，CER） 含銅的糖蛋白，分子量約1216萬(wàn)，含糖量約10%，因含銅而呈藍(lán)色，故名銅藍(lán)蛋白。CER具有氧化酶活性，使血液中Fe2+氧化成Fe3+，故又稱(chēng)亞鐵氧化酶。CER還起著抗氧化劑的作用。防止組織中脂質(zhì)過(guò)氧化物和自由基的生成，CER屬于急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，血漿CER在感染、創(chuàng)傷、腫瘤上升，Wilson病（肝點(diǎn)狀核變性）CER下降。CER測(cè)定方法，根據(jù)其氧化酶活性或免疫化學(xué)法，成人正常參考范圍0.20.5g/L。（九）轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TRF） 血漿中主要含鐵蛋白質(zhì)，分子量7.7萬(wàn)，含糖約6%，由肝及網(wǎng)狀皮系統(tǒng)合成，半壽期7天。主要運(yùn)載由消化道吸收的鐵

10、和RBC降解釋放的鐵，此外還可逆地結(jié)合多價(jià)金屬離子，如Ca、Zn、Cu等。TRF測(cè)定方法，擴(kuò)散法、放免法、散射比濁法，成人正常參考范圍2.24.0g/L。TRF在急性時(shí)反應(yīng)中下降，如炎癥、惡性病變時(shí)、TRF、Alb、PA同時(shí)下降，慢性肝病，營(yíng)養(yǎng)不良亦下降，妊娠、口服避孕藥，注射雌激素TRF上升。（十）2-微球蛋白（2-microglobulin，BMG） 分子量11800，存在于所有有核細(xì)胞的表面，特別是淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞并由此釋放入血，半壽期107mim。作為人類(lèi)淋巴細(xì)胞抗原鏈交部分。BMG測(cè)定方法，由于含量很低，常采用放免法，正常參考范圍1.02.5mg/L。主要用于監(jiān)測(cè)腎小管功能，特別是

11、腎移植后，如有排斥反應(yīng)，BMG在尿中排出量上升，腎功能衰竭，炎癥、腫瘤血漿BMG上升。（十一）C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP），是一種能結(jié)合肺炎雙球菌細(xì)胞壁C-多糖的蛋白質(zhì)，分子量11.514萬(wàn)，五條肽鏈組成，肝細(xì)胞合成。CRP能激活補(bǔ)體，促進(jìn)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和吞噬，具有調(diào)理素樣作用。CRP測(cè)定方法，免疫擴(kuò)散法，火箭免疫電泳法，ELISA法，放免法，正常參考范圍：成人0.425.2mg/L。作為急性時(shí)相反應(yīng)的一個(gè)極靈敏指標(biāo)，急性心肌梗死，創(chuàng)傷、感染、炎癥、外科手術(shù)、腫瘤浸潤(rùn)迅速上升。血漿蛋白質(zhì)的組成與含量組成分子量功能正常參考值臨床意義前白蛋白（PA）5.4萬(wàn)運(yùn)

12、載T3、T4、VitA0.2-0.4g/L營(yíng)養(yǎng)不良、腫瘤、急性炎癥、肝病白蛋白（Alb）6.6萬(wàn)維持膠滲、緩沖作用、運(yùn)輸作用35-55g/L慢性肝炎、肝硬化、腎炎1-酸性糖蛋白（AAG）4萬(wàn)與免疫功能有關(guān)0.5-1.5g/L風(fēng)濕病、惡性腫瘤、心肌梗塞1-抗胰蛋白酶（AAT）5.5萬(wàn)對(duì)抗溶酶體蛋白水解酶0.78-2g/L胎兒呼吸窘迫癥、肺氣腫、急性炎癥、妊娠甲胎蛋白（AFP）6.5-7萬(wàn)10-30g/L原發(fā)性肝癌羊水AFP胎兒產(chǎn)前監(jiān)測(cè)結(jié)合珠蛋白8-40萬(wàn)與血漿中游離Hb結(jié)合0.3-2.05g/LAlb丟失時(shí)、溶血時(shí)1-巨球蛋白（AMG）62.5-80萬(wàn)與蛋白水解酶結(jié)合影響其活性1.25-401g

13、/L低Alb、妊娠、口服避孕藥銅藍(lán)蛋白（CER）12-16萬(wàn)使Fe2+Fe3+，抗氧化劑0.2-0.5g/L感染、創(chuàng)傷、腫瘤、Wilson病轉(zhuǎn)鐵蛋白 (TRF)7.7萬(wàn)運(yùn)載Fe3+2.2-4.0g/L炎癥、惡性病變、慢性肝病妊娠、口服避孕藥2-微球蛋白（BMG）1.18萬(wàn)淋巴細(xì)胞抗原一部分1-2.6mg/L腎小管功能監(jiān)測(cè)，腎衰、炎癥、腫瘤C-反應(yīng)蛋白（CRP）10.5-14萬(wàn)激活補(bǔ)體、促進(jìn)粒C、巨噬C的運(yùn)動(dòng)和吞噬0.42-5.2mg/L急性心肌梗塞、創(chuàng)傷、感染、炎癥、手術(shù)后、妊娠上述蛋白質(zhì)除PA、Alb、BMG外都屬于糖蛋白，含糖量最高的是AAG、45%，除BMG外都主要由肝細(xì)胞合成。三、疾病

14、時(shí)的血漿蛋白質(zhì)（一）炎癥、創(chuàng)傷 在炎癥、創(chuàng)傷、感染、心肌梗塞、腫瘤等情況下其血漿濃度會(huì)發(fā)生明顯改變的蛋白質(zhì)稱(chēng)為急性時(shí)相反應(yīng)蛋白（acute phcse reactante，APR），主要包括AAG、AAT、Hp、CER、C3、C4、纖維蛋白原、CRP；PA、Alb、TRF。（二）肝臟疾病 血漿蛋白質(zhì)大多數(shù)是由肝細(xì)胞合成，因此肝臟疾病會(huì)導(dǎo)致多種血漿蛋白質(zhì)發(fā)生變化。如乙肝活動(dòng)期AAT、IgM；而Hp、PA、Alb。肝硬化時(shí)AAT、IgA、AMG；IgG；CER、CRP輕度；而AAG、Hp、C3；PA、Alb、TRF。（三）腎臟疾病 腎臟疾病早期可因蛋白尿而導(dǎo)致血漿蛋白質(zhì)丟失，丟失的蛋白質(zhì)與其分子量

15、有關(guān)，小分子蛋白質(zhì)丟失明顯，而大分子量蛋白質(zhì)因肝細(xì)胞代償性合成增加。主要表現(xiàn)是Alb，PA、AAG、AAT、TRF；而AMG、Hp、-LP。第二節(jié) 血漿蛋白質(zhì)測(cè)定臨床生化檢驗(yàn)中測(cè)定蛋白質(zhì)的方法很多，主要利用蛋白質(zhì)的分子組成，結(jié)構(gòu)或性質(zhì)進(jìn)行。一、測(cè)定蛋白質(zhì)特征元素氮 如凱氏定氮法，是測(cè)定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法，1883年Kjeldahl首創(chuàng)，精密度準(zhǔn)確度高，但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、技術(shù)性強(qiáng)，不適合臨床常規(guī)檢測(cè)，一般用于標(biāo)準(zhǔn)血清的標(biāo)定和校正。二、利用重復(fù)的肽鏈結(jié)構(gòu) 如雙縮脲法，1914年首創(chuàng)，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，各種蛋白產(chǎn)生的顏色反應(yīng)相近，但靈敏度較低，是目前臨床上測(cè)定總蛋白的常規(guī)方法。三、利用酪氨酸、色氨酸

16、殘基與試劑的反應(yīng)或紫外吸收 如：1. 酚試劑法 1921年，F(xiàn)olim首創(chuàng)，后又經(jīng)改進(jìn)，1951年Lowry改良成今法、靈敏度高（較雙縮脲法高100倍），主要用于微量蛋白質(zhì)檢測(cè)，但各種蛋白質(zhì)中酪氨酸含量不一，故準(zhǔn)確性較差，試劑配制復(fù)雜且不穩(wěn)定，化學(xué)干擾多，目前臨床上僅用于粘蛋白測(cè)定。2. 紫外吸收法 在280nm處有一吸收峰，快速、簡(jiǎn)單，不需加任何試劑，保留蛋白質(zhì)活性，化學(xué)干擾大。四、利用與染料的結(jié)合能力1. 考馬克斯亮藍(lán)G-250結(jié)合蛋白法（CBB法） 1976年Bradford應(yīng)用于蛋白質(zhì)測(cè)定，操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，靈敏度高，干擾因素少，但特異性不高，大分子肽（分子量300以上），也參

17、與反應(yīng)，線性范圍窄，臨床上主要用于尿、腦溶液蛋白質(zhì)測(cè)定。2. 溴甲酚綠結(jié)合清蛋白法（BCG法） 靈敏度高，血清用量少，操作簡(jiǎn)便，但特異性不高，部分球蛋白也能與之結(jié)合（1-球蛋白、運(yùn)鐵蛋白、觸珠蛋白等），是目前臨床上測(cè)定清蛋白的常規(guī)方法。五、利用沉淀后借濁度或光折射測(cè)定 如比濁法、折光測(cè)定法，方法簡(jiǎn)便，試劑易得，但濁度的強(qiáng)弱受反應(yīng)的條件影響大（加試劑的方法、溫度等），結(jié)果準(zhǔn)確性差，一般用于尿、腦脊液蛋白測(cè)定。六、電泳法 CAE、PAGE，目前臨床上常用電泳技術(shù)，但只能計(jì)算各種蛋白質(zhì)百分含量。七、利用免疫學(xué)特性 免疫化學(xué)法，特異性、靈敏度高，只能用于某種特異蛋白的測(cè)定。第三節(jié) 血清總蛋白的測(cè)定（雙

18、縮脲法）一、原理蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與二價(jià)銅離子作用生成紫紅色的絡(luò)合物，產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的含量成正比，但雙縮脲反應(yīng)并非蛋白質(zhì)特有的顏色反應(yīng)，分子中含二個(gè)以上肽鍵者有此反應(yīng)。二、雙縮脲試劑未失結(jié)晶水的硫酸銅（CuSO4·5H2O）3.0g溶于500ml新鮮制備的蒸餾水或剛煮沸冷卻的去離子水中，加酒石酸鉀鈉（NaKC4O4O6·4H2O）9.0g，碘化鉀5.0g，待完全溶解后加入6mol/L NaOH溶液100ml，最后加蒸餾水至1L，置聚乙烯瓶?jī)?nèi)蓋緊保存。酒石酸鉀鈉的作用是結(jié)合銅離子，維持銅離子在堿性溶液中的溶解度，碘化鉀防止兩價(jià)銅離子還原。三、

19、正常參考范圍：6080g/L四、臨床意義（一）血清總蛋白增高1. 血液濃縮 嚴(yán)重腹瀉 、嘔吐、高燒。2. 合成增加 主要見(jiàn)于球蛋白合成增加，多發(fā)性骨髓瘤。（二）血清總蛋白降低1. 血液稀釋 靜脈滴注過(guò)多低滲溶液，各種原因所引起的水鈉潴留。2. 攝入不足和消耗增加 營(yíng)養(yǎng)不良，慢性胃腸道疾病引起的消化吸收不良，消耗性疾病，結(jié)核病、甲亢、惡性腫瘤。3. 合成障礙 嚴(yán)重腫瘤4. 蛋白質(zhì)丟失 嚴(yán)重?zé)齻罅垦獫{滲出，腎病綜合癥。第四節(jié) 血清清蛋白測(cè)定（溴甲酚綠法）一、原理溴甲酚綠（BCG）在pH4.2的環(huán)境中，在有非離子去垢劑（Brij-35）存在時(shí)，可與清蛋白結(jié)合形成藍(lán)綠色復(fù)合物，顏色的深淺在一不定范

20、圍內(nèi)與清蛋白含量成正比。BCG與蛋白結(jié)合的特異性較低，它不僅與Alb結(jié)合呈色，還可與其他蛋白質(zhì)呈色，其中1-球蛋白，TRF、Hp最明顯，但反應(yīng)速度不同，Alb可立即反應(yīng)（快反應(yīng)），其他蛋白質(zhì)反應(yīng)慢（慢反應(yīng)）。二、試劑1. 10mmol/L BCG貯存液 BCG1.75g，溶于5ml 1 mol/L NaOH溶液中，加蒸餾水至250ml。2. 0.5mol/L在琥珀酸緩沖貯存液（pH4.0） NaOH10g，琥珀酸56g，溶解于800ml蒸餾水中，用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至4.10±0.05，加蒸餾水至1L。3. 疊氮鈉貯存液 疊氮鈉40g溶于1000ml蒸餾水中。4. Br

21、ij-35溶液 Brij-35 25g，加蒸餾水80ml，置60左右水浴使其溶解，然后加水至100ml。5. BCG試劑 于IL容量瓶?jī)?nèi)加蒸餾水400ml，琥珀酸緩沖貯存液100ml，BCG貯存液8ml，疊氮鈉貯存液2.5ml，Brij-35溶液2.5ml，加蒸餾水至刻度，配好的BCG試劑的pH應(yīng)為4.15±0.05。Brij-35可提高蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合力及溶解度，提高呈色穩(wěn)定性，如無(wú)Brij-35可用吐溫-20代替，疊氮鈉有防腐作用。三、正常參考范圍：355.5g/L。四、臨床意義1.血清清蛋白（1）增高常見(jiàn)于嚴(yán)重脫水所致的血漿濃縮。（2）降低臨床上較常見(jiàn)，與總蛋白降低的原因大致相同。急性降低常見(jiàn)于大量出血或嚴(yán)重?zé)齻?；慢性降低?jiàn)于腎病蛋白尿、肝功受損、腸道腫瘤與結(jié)核、慢性出血、營(yíng)養(yǎng)不良和消耗性疾病等。清蛋白如低于20g/L，患者可出現(xiàn)水腫。2.血清球蛋白（1）增高嚴(yán)重脫水、炎癥、免疫系統(tǒng)疾病和腫瘤。（2）降低血液稀釋、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)