PCR引物設(shè)計(jì)過(guò)程

1、PCR 引物設(shè)計(jì)過(guò)程一）設(shè)計(jì)引物前應(yīng)的準(zhǔn)備工作：1準(zhǔn)備載體圖譜，大致準(zhǔn)備把片斷插在那個(gè)部分 2對(duì)片斷進(jìn)行酶切分析，確定一下那些酶切位點(diǎn)不能用 3準(zhǔn)備一本所買(mǎi)公司的酶的商品目錄，便于查酶的各種數(shù)據(jù)及兩種酶是否可以配用二）引物的結(jié)構(gòu)： 5'保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn) +引物配對(duì)區(qū) 3' 1兩個(gè)酶切位點(diǎn) 2酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基 3 5'端保護(hù)堿基 4 3'端保護(hù)堿基 5引物配對(duì)區(qū)三）設(shè)計(jì)引物所要考慮的問(wèn)題1酶切位點(diǎn)兩個(gè)酶切位點(diǎn)應(yīng)是載體上的，所連接片斷上沒(méi)有這兩個(gè)位點(diǎn)， 且距離不能太近，否則往往導(dǎo)致兩個(gè)酶都切不好。因此，兩 個(gè)酶切位點(diǎn)要緊挨在一起，只能切一個(gè)，除非恰好是與上面 兩

2、個(gè)酶在一起的酶切位點(diǎn)，最好隔四個(gè)核苷酸。且不能有堿 基的交叉，比如 AGATCTTAAG ，這樣的位點(diǎn)比較難切。2酶的選擇最好使用雙酶切效率高的，但兩個(gè)酶切點(diǎn)最好不要是同尾酶切下來(lái)的殘基不要互補(bǔ)） ，否則效果相當(dāng)于單酶切，最好 使用具有共同 buffer ，且較常用的酶（如 hind3 ， bamh1 ，ecor1 等），這樣可以省錢(qián)。3 Tm 的計(jì)算。Tm 是由互補(bǔ)的 DNA 區(qū)域決定的，而不互補(bǔ)的區(qū)域?qū)?DNA的溶解是沒(méi)有作用的。因此，對(duì)于引物的Tm ，只有和模板 互補(bǔ)的區(qū)域?qū)?Tm 才有貢獻(xiàn)。計(jì)算 Tm 時(shí)，只計(jì)算互補(bǔ)的區(qū) 域（除非你的酶切位點(diǎn)也與模板互補(bǔ)） 。設(shè)計(jì)引物的時(shí)候， 先不管

3、5' 端的修飾序列，把互補(bǔ)區(qū)的 Tm 控制在 55 度以上我喜歡控制在 58 以上， 具體根據(jù) PCR 的具體情況， 對(duì)于 困難的 PCR ，需要適當(dāng)提高 Tm ），再加上酶切位點(diǎn)和保護(hù) 堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問(wèn)題，也可 以挽回。Tm 溫度高的引物就比較容易克服3'發(fā)卡、二聚體及 3' 非特 異結(jié)合等問(wèn)題。簡(jiǎn)單的計(jì)算公式可以用 2+4 的公式。 若你計(jì) 算的 Tm 值達(dá)到了快 90，不包括酶切位點(diǎn)。引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點(diǎn) 總長(zhǎng)分別為 29 、33 個(gè)堿基，去掉酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，分 別為 17、21 個(gè)堿基。 引物公司給的單子是 70 多

4、度， 實(shí)際用 的只有 50 度，用 55 度擴(kuò)的結(jié)果也差不多。的。自己可以再估計(jì)。如你設(shè)計(jì)了帶酶切位點(diǎn)的引物，其它關(guān)于 Tm 值的計(jì)算，有用 PP5.0 進(jìn)行評(píng)價(jià)的，需要考慮base number 、GC% 、Tm 、hairpin 、dimer 、falsepriming 、 cross dimer 等參數(shù)。4退火溫度退一般退火溫度為 Tm-5 度，退火溫度的計(jì)算可以不把加入 的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基考慮進(jìn)去，PCR 幾個(gè)循環(huán)后，引物外側(cè)的序列已經(jīng)參入了擴(kuò)增片斷中， 所以你可以在預(yù)變性后多加幾步，溫度比你 Tm 值低些（這 樣可能會(huì)增加非特異性） ，Tm 值是你包括酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿 基的 Pri

5、mer 計(jì)算出來(lái)的。55'端保護(hù)堿基般在 5'端加保護(hù)堿基 ,如果你擴(kuò)增后把目的條帶做膠回收轉(zhuǎn)入 T-VECTOR 或者其它的載體的話 ,酶切時(shí)可以不需加保護(hù)堿基6引物二聚體關(guān)于引物二聚體， 最好用 primer 或是其他設(shè)計(jì)引物的軟件進(jìn)行計(jì)算一下，看看引物之間的G （自由能）的絕對(duì)值，如果小于 10，一般是問(wèn)題的。如果稍大，PCR 時(shí)可以提高一下退火溫度，一般是沒(méi)有問(wèn)題的。如果3'端形成二聚體，并且自由能絕對(duì)值較大，如果PCR 沒(méi)有條帶， 建議重新設(shè)計(jì)引物。此外，所加的三個(gè)核苷酸的保護(hù)序列經(jīng)過(guò)盡心設(shè)計(jì)有時(shí)也可以降低二聚體的G。7引物的設(shè)計(jì)在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)，最好能盡可能

6、多的利用引物本身的堿基。這是因?yàn)?，一個(gè)特異性引物一般都是20bp 左右，再加上酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)性堿基，大致就是 28bp 左右了。而我們 在設(shè)計(jì)退火溫度時(shí)， 與引物的長(zhǎng)度有關(guān)， 比正常的引物 (20bp)的 Tm 肯定要高一些。 如果我們能利用引物自身的部分序列， 就可以有效地減少引物的長(zhǎng)度。還有，有些酶是離不開(kāi)末端序列的，因此，在設(shè)計(jì)一個(gè)酶位 點(diǎn)時(shí)，最好把該酶的性質(zhì)弄清楚。設(shè)計(jì)時(shí)限制性酶切位點(diǎn)是 應(yīng)該在 5'端的頂端。在設(shè)計(jì)引物時(shí)， 常在 5'端添加酶切位點(diǎn)，以利于 PCR 產(chǎn)物連接到載體。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后 5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。先用軟件設(shè)計(jì)出合適的引物，引物的 3'端是引發(fā)延伸的