微生物來源的具有促進(jìn)纖溶作用的低分子化合物的研究進(jìn)展

1、微生物來源的具有促進(jìn)纖溶作用的低分子化合物的研究進(jìn)展         07-06-14 16:49:00     作者：吳文惠，包斌    編輯：studa20【摘要】  歸納了纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)和纖溶酶原的活化在血栓溶解上的重要作用，分析了低分子化合物通過改變纖溶酶原空間結(jié)構(gòu)促進(jìn)血栓溶解的機(jī)理。重點(diǎn)敘述了到目前為止發(fā)現(xiàn)的complestatin,chloropeptin ,stablabin,sarfuctin,glucos

2、yldiacylglycerol等幾類具有促進(jìn)纖溶作用的低分子天然化合物和它們各自的特性，并且敘述了這些化合物促進(jìn)纖溶作用的機(jī)制。     【關(guān)鍵詞】  纖溶酶原；纖溶作用；低分了化合物       Review of low molecular weight compounds from the microbial metabolites that enhancing fibrinolysis     【Abstract】  The paper

3、 introduces fibrinolytic system,structure and activation of plasminogen with emphasis on the low molecular biosubstances found up to now and discussing their mechanism of enhancing fibrinolysis.    【Key words】  plasminogen;fibrinolysis;low molecular weight compounds  &#

4、160; 纖溶系統(tǒng)（纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)）具有溶解血栓的作用，此外它還與創(chuàng)傷治療、組織再建、血管新生、炎癥反應(yīng)、排卵、癌的形成與轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈硬化、病原菌的組織侵入等許多生理的、病理的變化過程相關(guān)1，2，纖維蛋白原是血液中的重要構(gòu)成蛋白質(zhì)，正常血漿的含量在24g/L，纖維蛋白原由3種線狀的糖蛋白分子所構(gòu)成，蛋白質(zhì)長鏈通過二硫鍵結(jié)合在一起形成分子量為34萬的纖維蛋白原大分子，以溶解狀態(tài)參與血液循環(huán)，通過血液凝固反應(yīng)，在凝血酶的作用下纖維蛋白原能被轉(zhuǎn)變成不溶的纖維蛋白（血栓）沉積在血管壁上。纖溶系統(tǒng)的纖溶酶原和纖溶酶原激活劑通過賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)與纖維蛋白相結(jié)合，在該結(jié)合部位形成的纖溶酶將纖維蛋白分解，纖

5、溶酶原被兩種纖溶酶原激活劑（plasminogen activator,PA)尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator,uPA)和組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator,tPA)激活成具有活性的纖溶酶，該纖溶體系的活性以及纖溶酶原轉(zhuǎn)換成纖溶酶的變化過程被PA抑制劑PAL-1（plasminogen activator inhibitor 1)、2-抗纖溶酶（2-antiplasmin)所調(diào)節(jié)。    在血液凝固-纖溶體系，一些生理活性成分能夠通過（1）促進(jìn)非活

6、化狀態(tài)的纖溶酶原向活化的纖溶酶的轉(zhuǎn)化；（2）提高纖溶酶原的血栓結(jié)合活性；（3）改變纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)使該酶原處于容易被纖溶酶原激活劑活化的狀態(tài)；（4）促進(jìn)血液中微量存在的尿激酶型纖溶酶原激活劑前體（prourokinase)向尿激酶型纖溶酶原激活劑的轉(zhuǎn)化從而開始纖溶作用的爆發(fā)式血栓溶解反應(yīng)，來加快纖溶酶原向纖溶酶的轉(zhuǎn)化或促進(jìn)纖溶酶的纖維蛋白（血栓）酶解反應(yīng)過程，血管中因病理作用生成的血栓將被溶解并進(jìn)而消除血    栓癥。從天然化合物中探索針對于纖溶體系的酶原、酶的 特異性生理活性物質(zhì)作為血栓癥的治療藥物將不存在生理性的出血危險(xiǎn)性，并且會適用于慢性及早期血栓癥狀?；?/p>

7、 于上述事實(shí)和理論基礎(chǔ)，利用纖溶體系的酶原3，18（plasminogen,prourokinase)、血栓構(gòu)筑的in vitro檢索體系從微生物和海藻的代謝產(chǎn)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了纖溶酶原的活性促進(jìn)物質(zhì)如complestatin,staplabin,plactins,surfactin和尿激酶型纖溶酶原激活劑前體的內(nèi)因性活性促進(jìn)物質(zhì)glucosyldiacylglycerol等，這些化合物的促進(jìn)纖溶作用或者是剛被發(fā)現(xiàn)、或者是活性低等原因，離臨床應(yīng)用還需要作大量的研究。但由于低分子化合物在微血栓、慢性血栓和使用上的巨大潛力和安全性，在溶血栓藥物的研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)和研究低分子纖溶促進(jìn)化合物正在成為探索新型

8、纖溶療法藥物的重要途徑。一些研究者在探索促進(jìn)纖溶作用的低分子天然化合物時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一些具有促進(jìn)纖溶作用的化合物，本文歸納了這些化合物的探索途徑、分離純化、特性和促進(jìn)纖溶作用的機(jī)制。    1  纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)和活化    在血液中循環(huán)的纖溶酶原（Glu1-plasminogen;Glu-Plg)具有閉合的空間結(jié)構(gòu)，在血液中被纖溶酶原激活劑低效率的活化4，5，這種閉合型的空間結(jié)構(gòu)被存在于N末端80個(gè)殘基（N-terminal peptide,NTP)中的賴氨酸殘基（Lys50或Lys60）與存在于第5個(gè)鏈回環(huán)（K5）上的氨基

9、已糖結(jié)合位點(diǎn)形成分子內(nèi)結(jié)合鍵所維持5，6，當(dāng)?shù)?個(gè)鏈回環(huán)上的氨基已糖結(jié)合位點(diǎn)與纖維蛋白（或細(xì)胞受體）相結(jié)合時(shí)，NTP-K5的相互作用被解除，纖溶酶原分子被轉(zhuǎn)變成開放型的結(jié)構(gòu)，纖溶酶原分子在空間馳豫，從而裸露在纖維蛋白（血栓）表面的賴氨酶殘基與纖溶酶原上顯露出來的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，在空間馳豫的纖溶酶原被結(jié)合到纖維蛋白表面，纖溶酶原進(jìn)一步被存在于其附近的組織型纖溶酶原激活劑（t-PA)高效率的轉(zhuǎn)變成纖溶酶。由于纖溶酶原其分子結(jié)構(gòu)上的閉合狀態(tài)與開放狀態(tài)的轉(zhuǎn)化特性（圖1），在纖維蛋白（或是細(xì)胞間質(zhì)）上，纖溶酶原的活性表現(xiàn)出是局域性的，血栓（纖維蛋白）溶解最先開始于賴氨酸殘基的周圍，其作用機(jī)理如圖2

10、所示。另外，隨著纖溶的進(jìn)行，Glu-Plg的N末端短肽被絲氨酸蛋白酶纖溶酶所切斷，Lys78-plasminogen (Lys-Plg)在纖溶酶所出現(xiàn)的區(qū)域產(chǎn)生，Lys-Plg分子由于不帶有NTP-K5分子內(nèi)結(jié)合鍵，所以是開放型構(gòu)造，容易活化，并且通過高親和性與纖維蛋白結(jié)合。低分子化合物-氨基已酸（epsilon-aminocapronic acid)或氨甲環(huán)酸(tranexamin acid)結(jié)合在K5鏈回環(huán)的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)，使Glu-Plg成開放性構(gòu)型，因此，賴氨酸類似物顯著地促進(jìn)Glu-Plg的活性化，但與此相對，賴氨酸類似物阻礙了纖溶反應(yīng)（纖維蛋白的分解），這是由于介于纖溶酶原鏈回環(huán)上

11、的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)的Glu-Plg-纖維蛋白復(fù)合物的形成被阻抑了。在纖維蛋白溶解反應(yīng)的局域性和纖溶反應(yīng)的高效性上，血液中的Glu-Plg與纖維蛋白的結(jié)合以及由此帶來的空間結(jié)構(gòu)的變化發(fā)揮著重要的作用。纖溶酶原是由791個(gè)氨基酸構(gòu)成的單鏈糖蛋白，構(gòu)成糖約占分子量的2%。從N末端開始順次分為N末端短肽結(jié)構(gòu)域（N-terminal peptide,NTP)、5個(gè)鏈回環(huán)結(jié)構(gòu)域（kringle 1,kringle 2,kringle 3,kringle 4,kringle 5)、酶活性中心結(jié)構(gòu)域和C末端氨基酸。酶活性中心在His603-Asp645-Ser740,uPA或tPA限定分解Arg561-Val5

12、62肽鍵（圖中的虛心箭頭位置）成雙鏈的纖溶酶，PA（plasminogen activator)切斷Arg561-Val562肽鍵后，N端的A鏈（或重鏈）C端的B鏈（或輕鏈）。    圖中圓圈和其中的字母表示具體的氨基酸及其位置：數(shù)字表示從N末端起始的氨基酸序列：實(shí)心箭頭表示彈性蛋白酶（elastase）、胃蛋白酶（pepsin)、鮮黃蛋白酶V8(aureus V8 protease)的水解位點(diǎn)，共6個(gè)；虛心箭頭表示纖溶酶原激活劑的作用位點(diǎn)；短橫線表示分子內(nèi)二硫鍵，共23個(gè)；短折線表示糖鏈；實(shí)心圓圈和其中的字母表示活性中心氨基酸及其位置。  &

13、#160; Glu-Plg由NTP、5個(gè)鏈回環(huán)結(jié)構(gòu)域（K1K5）、絲氨酸蛋白酶活性中心結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，在K1、K2、K4、K5存在賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)，K5的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)由于也能識別氨基已糖，所以又稱作氨基已糖結(jié)合位點(diǎn)，能結(jié)合肽鏈中的賴氨酸。Glu-Plg分子的NTP Lys50(或Lys62)在K5的AH位點(diǎn)上形成分子內(nèi)結(jié)合鏈，維持著緊密的空間結(jié)構(gòu)，對活化作用顯示出抵抗性。通過K5與纖維蛋白或細(xì)胞受體的結(jié)合，以及纖溶酶切斷NTP，都會使纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生馳豫，從而感受到PA的活性化。    2  促進(jìn)纖溶作用的化合物    到

14、目前為止，主要的纖溶促進(jìn)化合物（圖3）的特性被歸納在表1，這些化合物的探索途徑、分離純化和纖溶促進(jìn)機(jī)制分述如下。      圖3  促進(jìn)纖溶作用的低分子天然化合物 表1  具有纖溶促進(jìn)作用化合物的特性注：-沒有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；*含有不同于纖溶酶原作用特點(diǎn)的特征    2.1  complestatin和chloropeptin 1  以纖溶酶原和纖溶酶原受體構(gòu)成in vitro檢索體系，用于探索促進(jìn)纖溶酶原向受體結(jié)合的低分子天然化合物。認(rèn)為促進(jìn)纖溶酶原向纖溶酶原受體結(jié)合的化合物也會

15、促進(jìn)纖溶酶原和纖維蛋白（血栓）的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)血栓的溶解。以U937細(xì)胞作為纖溶酶原受體的供體，使用人纖溶酶原構(gòu)成了纖溶促進(jìn)化合物的檢索體系，在對約5000株微生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選的基礎(chǔ)上，從鏈霉菌屬（Streptomyces)的一株代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了低分子化合物圖3）complestatin和chloropeptin 17,8促進(jìn)了纖溶酶原向U937纖溶酶原受體的結(jié)合。該化合物是從土壤的分離菌株中分離純化的，將活化培養(yǎng)的種子液接種到由可溶性淀粉3%、肉膏1%、混合溶液1.5%、玉米浸出汁2%和消泡劑CB442 0.01%構(gòu)成的液體培養(yǎng)基（pH7.0）中，在25、310 rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)

16、3天，收獲的菌絲用70%丙酮溶液提取，提取物用乙酸乙酯萃取，萃取物經(jīng)丙酮-甲醇（5：1）硅膠層析后，活性化合物被移動(dòng)相為含0.2%三氟醋酸的45%乙氰水溶液的高壓液相色譜柱（Inertsil PREP-ODS)所精制。    chloropeptin 1是complestatin (c61H45N7O15Cl6,MW1325)的異構(gòu)體，只在苯甘氨酸-色氨酸殘基的結(jié)合位置不同。complestatin和chloropeptin 1在0.510M的添加濃度下，使Glu-Plg向U937細(xì)胞的結(jié)合增加了25倍，這些化合物由于也增加了Glu-Plg和纖維蛋白的結(jié)合，所以可

17、以認(rèn)為這些化合物是作用于纖溶酶原的，另外，這些化合物的作用能被-氨基已酸所阻礙，并且從化合物的作用特點(diǎn)能認(rèn)為纖溶酶原和U937細(xì)胞沒有形成新的結(jié)合方式，是complestatin和chloropeptin 1促進(jìn)了纖溶酶原和U937細(xì)胞介于賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的增加。伴隨著纖溶酶原向細(xì)胞或纖維蛋白結(jié)合的增加，細(xì)胞或纖維蛋白上纖溶酶的生成也增加了。在使用全血形成血栓的纖溶實(shí)驗(yàn)上，確認(rèn)了兩種化合物介于tPA促進(jìn)了血栓的溶解8，這之后，又確認(rèn)了這些化合物帶來了Glu-Plg空間結(jié)構(gòu)的變化以及促進(jìn)了介于uPA的Glu-Plg的活性化，從Glu-Plg空間結(jié)構(gòu)的變化也能說明Glu-Plg向U937細(xì)胞結(jié)合

18、的增加。另外，這些化合物不能直接促進(jìn)纖溶酶以及纖溶酶原激活劑的酰胺分解活性。    2.2  萜類化合物（staplabin,SMTPs: Stachybotrys Microspora Triprenyl Phenol)  在探索Glu-Plg和纖維蛋白結(jié)合的促進(jìn)化合物上，利用纖溶酶原-尿激酶前體-S2251的in vitro篩選體系，從微生物的培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn)了新型的萜類代謝產(chǎn)物9，這之后，又發(fā)現(xiàn)了8種新型同類化合物1012。Staplabin（圖3）具有顯著的促進(jìn)纖溶作用，該化合物分離于土壤微生物Stachybotrys Microspora的

19、一個(gè)菌株。將經(jīng)過種子培養(yǎng)的菌株接種到1L培養(yǎng)液含30g葡萄糖、10g脫脂豆粉、3g肉膏、3g酵母粉、3g蛋白粉、0.5g磷酸二氫鉀、0.5g七水硫酸鎂和0.1g消泡劑CB442的培養(yǎng)基中，在25、180rpm用500ml三角瓶連續(xù)培養(yǎng)35天，培養(yǎng)液離心后，上清液用等量的2-丁酸抽提，抽提物用二氯甲烷和甲醇展開于硅膠層析柱，活性成分被Inertsil SIL-ODS精制，移動(dòng)相是流速為9.9ml/min的乙烷和乙醇（98：2）的混合溶液。    300500M的staplabin使Glu-Plg和Lys-Plg與纖維蛋白的結(jié)合增加了，這種增加依賴于Glu-Plg和Lys-Plg上的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)，并且在纖溶酶原激活劑存在下，Glu-Plg和Lys-Plg的活化被促進(jìn)了，所以體現(xiàn)出提高了纖溶酶的分解活性13，在使用分子排除層析的實(shí)驗(yàn)上由于該化合物部分地縮短了Glu-Plg和Lys-Plg的溶出時(shí)間，所以被認(rèn)為該化合物使這些分子馳豫。纖溶酶原活性化的促進(jìn)作用在-氨基已酸（epsilon-aminocapronic acid)和纖溶酶原斷片存在的情況下也能觀察到，所以能認(rèn)為staplabin帶來的構(gòu)型的變化和complestatin這些化合物帶來的變化是不同的13，這種結(jié)果，也被staplabin的活性化促進(jìn)作用能在mini-Plg上觀察到的事實(shí)所支持。SM