樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的主動性免疫治療

1、樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的主動性免疫治療樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell, DC） 是一類具有典型樹突狀形態(tài)、膜表面高表達(dá)MHC-II類分子、具有相對特異性表面標(biāo)志，并能移行至淋巴器官和刺激初始T細(xì)胞進(jìn)行活化增殖的一類免疫活性細(xì)胞。DC 最早由Steinman和Cohn等發(fā)現(xiàn)，是體內(nèi)抗原遞呈功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞。由于DC在免疫應(yīng)答是啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。因此利用DC在患者體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤特異性的、持久的免疫應(yīng)答，是目前將DC-腫瘤疫苗用于治療惡性腫瘤的基礎(chǔ)。利用采用負(fù)載靶抗原的DC治療性疫苗已經(jīng)在腫瘤和感染性疾病的治療研究中取得了令人矚目的進(jìn)展，如治療激素耐受的前列腺癌已經(jīng)進(jìn)入

2、III期臨床研究，我國第一項DC疫苗治療轉(zhuǎn)移性大腸癌的研究也已經(jīng)進(jìn)入II期臨床研究。 一、DC的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)人類DC起源于骨髓造血祖細(xì)胞、分屬兩個不同的亞群即髓樣DC(myeloid DC，MDC)和淋巴樣DC(1ymphoid DC,LDC)，分別起源于CD34的髓系造血干細(xì)胞和淋巴系造血干細(xì)胞。髓樣DC在體內(nèi)分布非常廣泛，在淋巴組織和非淋巴組織中，MDC可分為在多種生長因子的作用下人類骨髓和臍帶血中的CD34的髓系前體細(xì)胞及外周血中CDI4單核細(xì)胞分化成DC1，而胸腺、脾臟和外周血中的T細(xì)胞前體細(xì)胞及扁桃體中的漿細(xì)胞樣細(xì)胞分化成DC2。人類DC1表達(dá)CDIa、CDIlb和CDIlc，

3、DC2不表達(dá)CDIa、CDIlb和CDIlc，鼠DC1不表達(dá)CD8a、而表達(dá)CDIlb、CDIlc、不或低表達(dá)DEC-205，鼠DC2表現(xiàn)為CD8a、CDI lb低表達(dá)和DEC一205高表達(dá)。DC具有其他免疫細(xì)胞所沒有的形態(tài)特點(diǎn)和運(yùn)動能力，分布廣泛，DC有兩個不同的功能亞群，分別稱為DC1和DC2。不成熟DC在外周組織攝取、處理人侵的抗原后，經(jīng)過成熟和遷移途徑到達(dá)二級淋巴組織，致敏(priming)初始Th細(xì)胞，在此，DC把不同類型抗原信號傳遞給初始 Th 細(xì)胞，使后者定向分化為Thl或Th2細(xì)胞亞群，其中DC1誘導(dǎo)Thl分化，DC2誘導(dǎo)Th2分化。人DC1/DC2亞群人DCI和DC2亞群的概

4、念最早由DNA研究所的Rissoan于1999年提出，他們在體外用不同細(xì)胞因子組合培養(yǎng)誘導(dǎo)出兩種不同功能的人DC亞群。人DC1亞群人外周血單核細(xì)胞 DC 前體（pDC1）加 GM-CSF 和 IL-4 培養(yǎng)后分化為不成熟髓樣 DC，再用CD40L或LPS刺激后變?yōu)槌墒焖铇覦C，這種DC亞群表達(dá)高水平 GM-CSF 受體和低水平 IL-3 受體，分泌大量IL-12，誘導(dǎo)人Thl 應(yīng)答，因此稱為人 DCI 亞群。除 IL-12 以外，人DCI亞群還分泌 IL-la、IL-l b、IL-6、IL-8和IL-10,但不分泌lL-4。分離人外周血或扁桃腺中漿細(xì)胞樣DC前體細(xì)胞（pDC2），加人IL-3培

5、養(yǎng)，再用CD40L刺激，pDC2即分化為成熟淋巴樣DC，它表達(dá)高水平IL-3Ra和低水平GM-CSF受體，僅分泌低水平IL-12，可誘導(dǎo)人Tll2應(yīng)答，故命名為人DC2亞群。與人Th2亞群不同的是，人DC2亞群不分泌IL-4，而且體外加人IL-4還對pDCZ有殺傷作用。顯然，人DC2亞群利用了IL-4以外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使初始 Th 細(xì)胞向 TllZ 亞群分化。體外用單抗交聯(lián)人DC2細(xì)胞上的CD40分子，還可刺激其分泌 IL-8。人pDC2和DC2亞群具有明顯的淋巴細(xì)胞譜系特征：幾乎不表達(dá)髓樣抗原，如CDllb、CDllc、CD13和CD33；體外加人GM-CsF和M-CSF培養(yǎng)，不能分化為巨噬

6、細(xì)胞； 吞噬、巨胞飲抗原的能力始終很弱；存活和成熟依賴 IL-3，不依賴GM-CSF；高表達(dá)前T細(xì)胞受體a鏈（pTCRa）。20世紀(jì)80年代早期，曾報道在外周血中發(fā)現(xiàn)一種分泌大量IFN-的細(xì)胞，起名為天然干擾素產(chǎn)生細(xì)胞（natural interferon producing cell,IPC）?，F(xiàn)有證據(jù)表明，IPC表達(dá)CD4和MHC-II類分子，可能就是pDC2。受到HSV刺激時，分離純化的pDC2比外周血全白細(xì)胞分泌的 IFN-。含量高1000倍。二、DC 對抗原的攝取、加工遞呈（一）DC 攝取外源性抗原的機(jī)制 對于大多數(shù)細(xì)菌、真菌及胞外寄生蟲等外源性抗原，不成熟 DC 可通過吞噬、微胞飲

7、、巨胞飲或借助于細(xì)胞表面的模式識別受體（PRR），如SR、MR、DEC-205、CR和 FcR等將抗原攝入胞內(nèi)。 1. 吞噬作用 吞噬作用（phagocytosis）是指細(xì)胞攝取直徑大于 0.5 m 的顆粒性物質(zhì)和微生物的一種方式。 2. 吞飲作用吞飲作用（pinocytosis）是DC 攝取胞外少量液體的方式。m。體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞均存在微胞飲現(xiàn)象。(2)巨胞飲（macropinocytosis）: 所謂巨胞飲是相對于微胞飲而言，巨胞飲更像吞噬運(yùn)動，它形成的巨胞飲泡直徑可達(dá) 13 m ，可承載大量外源性液體和溶質(zhì)。體內(nèi)只有巨噬細(xì)胞和 DC 具有巨胞飲能力，其中 DC 的巨胞飲能力比巨噬細(xì)胞更強(qiáng)

8、。(3)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞巨噬細(xì)胞表面受體: DC也表達(dá)多種類似PRR，如DEC-205、FcgR和FceR。這些受體均可介導(dǎo)抗原內(nèi)吞。其中C型凝集素家族DEC-205和低親和力FcgIIR所起作用最大，DC在體外對甘露糖化的蛋白質(zhì)分子的呈遞作用比非糖基化的高100倍。MR和DEC-205主要結(jié)合甘露糖化和巖藻糖化的抗原分子 ，巨噬細(xì)胞和DC將MR-抗原復(fù)合物一同內(nèi)化入細(xì)胞內(nèi)體中，內(nèi)體和溶酶體進(jìn)一步融合成內(nèi)體溶酶體，MR-抗原復(fù)合物在內(nèi)體溶酶體的酸性環(huán)境中解離，釋放出抗原分子；而 Fcg R 結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物則是在內(nèi)化后一起降解。（二）DC 加工處理抗原的機(jī)制 對于大多數(shù)病毒、胞內(nèi)寄生菌和胞

9、內(nèi)寄生蟲等內(nèi)源性抗原（endogenous antigen），DC 可被其直接感染，這些病原體從而在DC 胞漿內(nèi)合成病原體蛋白分子，即所謂的內(nèi)源性抗原。然后DC 通過胞質(zhì)溶膠途徑將病原體抗原切割為 810 個氨基酸的肽段，在 TAP1 / TAP2的轉(zhuǎn)運(yùn)下進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，加載到 MHC - I 類分子的肽結(jié)合溝槽內(nèi)， MHC -I 抗原肽段復(fù)合物再經(jīng)分泌途徑表達(dá)在DC 表面。2. 外源性抗原的呈遞外源性抗原被巨噬細(xì)胞或 DC 攝取后在內(nèi)體溶酶體中被組織蛋白酶切割成 14 - 20 個氨基酸的短肽，與 MHC -II 類分子組裝成 MHC-II/抗原肽段復(fù)合物，經(jīng)高爾基體分泌途徑表達(dá)在巨噬細(xì)胞和 D

10、C 表面。3.DC 對外源性抗原的交叉遞呈 一般情況下，內(nèi)源性抗原通過MHC-I類分子遞呈，外源性抗原通過MHC-II途徑呈遞。但在體內(nèi)此規(guī)律并不是絕對的，有些情況下，MHC-I類分子也可以呈遞外源性抗原, DC 和巨噬細(xì)胞都能通過胞質(zhì)溶膠途徑呈遞外源性抗原，其中 DC 的這種能力更強(qiáng)。對于腫瘤抗原和移植物抗原， DC 能通過胞質(zhì)溶膠途徑進(jìn)行呈遞，誘導(dǎo) CD8的CTL應(yīng)答。此外，巨噬細(xì)胞還能利用其表面的 MR 攝入病原體糖脂類抗原，加工處理后與非經(jīng)典 MHC-I類分子CDlb結(jié)合。近年來進(jìn)行的研究使人們初步對這種現(xiàn)象的機(jī)制有了一定的認(rèn)識。 (1)交叉致敏和交叉呈遞交叉致敏（cross prim

11、ing）：這個概念最早由 Bevan 在加世紀(jì) 70 年代進(jìn)行同類系小鼠組織移植時提出。同類系小鼠的MHC抗原完全相同，但次要組織相容性抗原（minor histocomPatibihty antigen,mHA）不同，結(jié)果也能發(fā)生移植排斥反應(yīng)，Betran發(fā)現(xiàn)受者APC可以呈遞供者細(xì)胞表面的 mHA ，活化致敏受者 CTL。近年研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi) MHC-I類分子也可以組成性呈遞外源性自身肽段，人們把這種現(xiàn)象稱為交叉呈遞（ cross presentation ）。(2) MHC-I類分子呈遞外源性杭原的機(jī)制：MHC-I 類分子呈遞外源性抗原至少存在兩種不同的機(jī)制。一種是 TAP 依賴方式的，A

12、PC攝入的外源性抗原可從內(nèi)體中逃逸出來，進(jìn)人細(xì)胞溶膠，然后被細(xì)胞溶膠中的蛋白酶體切割為肽段，再經(jīng) TAP1/TAP2的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，加載到 MHC-I類分子膚結(jié)合溝槽內(nèi)，HSP也可以將抗原膚段送入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。此方式和經(jīng)典的內(nèi)源性抗原呈遞機(jī)制非常相似。另一種方式則是 TAP非依賴的，抗原不需要細(xì)胞溶膠中蛋白酶體的切割以及 TAP 的轉(zhuǎn)運(yùn)，而依然是在內(nèi)體溶酶體中被組織蛋白酶水解。然而切割后形成的抗原肽段是如何加載到 MHC-I 類分子上的還不清楚，目前認(rèn)為可能有下列三種途徑：內(nèi)體溶酶體中產(chǎn)生的抗原肽段經(jīng)某種機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，直接和胞膜上的MHC-I類分子結(jié)合；胞膜上的 MHC-I類分子內(nèi)化進(jìn)入內(nèi)體溶酶

13、體與抗原肽段結(jié)合；部分在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的 MHC-I 類分子可與恒定鏈（ Ii ）結(jié)合，在Ii鏈的引導(dǎo)下進(jìn)人內(nèi)體溶酶體與抗原肽段結(jié)合。體外實驗顯示，在高劑量可溶性抗原存在下， APC可以通過 MHC-I 類分子呈遞抗原。將外源性可溶性抗原包被到顆粒物質(zhì)或載體細(xì)胞表面或直接利用電穿孔方法將性抗原導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，可以使外源性抗原進(jìn)入細(xì)胞溶膠途徑。三、DC誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答盡管DC在外周血中所占極微，但它們大部分分布于機(jī)體的門戶部位，如皮膚、黏膜，組成機(jī)體的哨兵部隊。危險信號，如應(yīng)激反應(yīng)和炎癥因子（TNFa、IL-1b、MIP-3a），能夠加速血中的DC前體向外周遷移。外周組織的DC處于未成熟狀態(tài)，具有較強(qiáng)的

14、吞飲、吞噬能力以獲取抗原。DC獲取抗原通過4種方式：吞噬方式獲取顆粒性抗原；通過巨吞飲作用或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（甘露糖受體、Fcg、DEC-205受體）獲取可溶性抗原；直接獲取凋亡細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞表面的抗原性物質(zhì)，又稱交叉致敏。獲取的抗原性物質(zhì)在DC細(xì)胞內(nèi)被降解為小分子片段，然后在胞內(nèi)一系列分子的幫助下，裝載到MHC-或MHC-分子上，運(yùn)送到細(xì)胞表面，等待呈遞給T細(xì)胞。而捕獲抗原后的DC，一方面在胞內(nèi)進(jìn)行抗原的加工，另一方面將進(jìn)行從外周-輸入淋巴管-淋巴組織的T細(xì)胞區(qū)域的遷移過程，并且在這個遷移過程中DC逐漸成熟。進(jìn)入淋巴結(jié)T細(xì)胞區(qū)域的DC能與初始型T細(xì)胞形成穩(wěn)定的聚集體并激活T細(xì)胞，這有賴

15、于DC和T細(xì)胞表面表達(dá)互為配受體的黏附分子。而DC表面的MHC-抗原肽復(fù)合體與T細(xì)胞的TCR-CD3的相互作用，向T細(xì)胞傳遞抗原信號，啟動后續(xù)DC與T細(xì)胞之間的共刺激分子之間的相互作用，如DC表面的CD40分子與T細(xì)胞表面的CD40L結(jié)合，促進(jìn)DC表達(dá)共刺激分子CD80/CD86，后者與T細(xì)胞表面的CD28/CTLA-4結(jié)合構(gòu)成T細(xì)胞活化必不可少的共刺激信號；此外，在這個過程中DC分泌IL-12，T細(xì)胞分泌IL-2、IFN-g等，通過旁分泌或自分泌方式，與上述雙信號共同誘導(dǎo)初始T細(xì)胞的活化， DC在發(fā)揮功能的同時也獲得了最終成熟。在DC與T細(xì)胞相互作用的過程中，分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子，除了

16、促進(jìn)各自的增殖活化，還可以趨化其它免疫細(xì)胞，共同參與免疫應(yīng)答，對免疫應(yīng)答起到放大作用。DC可以誘導(dǎo)不同類型的T細(xì)胞介導(dǎo)的不同的免疫應(yīng)答，這與DC的亞群及它們接受的抗原刺激以及免疫途徑有關(guān)。腫瘤、病毒、同種抗原主要誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，由DC1啟動。DC1產(chǎn)生IL-12誘導(dǎo)Th1分化、分泌IL-2和IFN-g，并活化CD8CTL和CD4CTL為特征。此外，CD8CTL可以不經(jīng)過輔助性T細(xì)胞的幫助直接接受DC呈遞的抗原而活化（cross-priming）。因此，Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)能夠保護(hù)機(jī)體免受病毒、腫瘤的侵犯。相反，Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)通過Th2分泌IL-10、IL-

17、4抑制DC對Th1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，從而對Th1細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤抗病毒免疫應(yīng)答有下調(diào)作用。目前發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織微環(huán)境中存在大量的IL-10，抑制DC誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化的作用，導(dǎo)致機(jī)體對腫瘤組織的耐受狀態(tài)。成熟活化的DC除了與初始型T細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)抗原特異性CTL外，還可以通過直接或間接方式影響B(tài)細(xì)胞的增殖，活化體液免疫應(yīng)答；與記憶T細(xì)胞相互作用誘發(fā)再次免疫應(yīng)答；與NK作用促進(jìn)機(jī)體建立非特異性的、天然免疫應(yīng)答。四、腫瘤抗原致敏的樹突狀細(xì)胞在臨床中的應(yīng)用策略可以預(yù)防和治療癌癥的疫苗DC，有望成為有效消滅腫瘤患者體內(nèi)殘存腫瘤細(xì)胞，成為預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)的新手段。這是柳葉刀中文版、世界核心醫(yī)學(xué)期刊等雜志特

18、約編輯，北京武警總隊第二醫(yī)院生物診療中心王順濤教授，在10月21日至23日召開的腫瘤基礎(chǔ)與治療國際研討會上透露的。王順濤主任提出，樹突狀細(xì)胞（ DC）是來源于患者外周血和骨髓專職的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，它通過捕捉、加工處理各種細(xì)菌、病毒以及腫瘤抗原，在樹突狀細(xì)胞表面生成大量能激發(fā)免疫反應(yīng)的肽復(fù)合物，并在多種協(xié)同刺激分子和大量免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的輔助下，激活 T細(xì)胞，誘導(dǎo)出高效殺傷腫瘤的免疫反應(yīng)。他說，該研究選擇了25例消化道腫瘤患者，進(jìn)行該項治療的體外研究，結(jié)果表明，該特異性殺傷細(xì)胞對特異性腫瘤細(xì)胞的殺傷力比非特異性殺傷力提高2035。肽疫苗治療腫瘤在打破患者免疫抑制，重新啟動自體免疫力的作用上高于以往的免疫治療