酶聯(lián)免疫的培訓(xùn)

1、酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及在三聚氰胺檢測(cè)中的基本原理及操作技術(shù)培訓(xùn)資料 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒基本原理及操作技術(shù)培訓(xùn)資料 基本理論 1、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）簡(jiǎn)介1.1、基本概念：抗原：抗原是指進(jìn)入人或動(dòng)物機(jī)體后，可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，從而引起動(dòng)物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細(xì)胞，并能和抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)?？贵w：是由抗原刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生分泌的能和相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。抗原抗體的基本特性：a、反應(yīng)的特異性；b、反應(yīng)的等比例性1.2、ELISA方法簡(jiǎn)介：ELISA屬于標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)的一種，1971年由荷蘭和瑞典的學(xué)者提出，由于其操作過程簡(jiǎn)單

2、易行并可以定量，從而使其在食品安全和衛(wèi)生檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。目前市場(chǎng)上有多種基于ELISA方法開發(fā)的用于食品中抗生素檢測(cè)的試劑盒產(chǎn)品。1.3、ELISA方法的原理基于抗原抗體反應(yīng)的特異性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板（又稱酶標(biāo)板）為載體，在適當(dāng)?shù)募夹g(shù)條件下使抗原或抗體包被（吸附）在酶標(biāo)板微孔的內(nèi)壁上成為所謂的包被（固相）抗體或抗原，沒有被吸附（游離）的抗原或抗體通過洗滌除去，然后直接加入酶標(biāo)記抗體或抗原（或先加入適當(dāng)?shù)目贵w或抗原與包被抗原或抗體反應(yīng)后，再加入相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體或抗原），形成酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物固定在微孔內(nèi)，沒有吸附的酶標(biāo)記物洗滌去除，加入底物溶液于微孔中，復(fù)合物上

3、的酶催化底物使其水解、氧化或還原成為有色的底物。在一定的條件下，復(fù)合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗體復(fù)合物的量）和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的量。這就是ELISA的原理。1.4、ELISA方法的分類ELISA可以分為直接法、間接法和夾心法等幾種。直接法：直接法是指酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出包被在酶標(biāo)上的抗體或抗原的量。見圖2-17（a）間接法：是將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成復(fù)合后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過測(cè)定

4、酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以（間接）反應(yīng)一抗和抗原的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗原或抗體的量。見圖2-17（b）夾心法：是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，在用酶標(biāo)的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物；也可以象間接法一樣應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體-抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，見圖2-17（C）。前者稱為直接夾心法，后者稱為間接夾心法。上述三種方法又可以分為競(jìng)爭(zhēng)法和非競(jìng)爭(zhēng)法。由于目前市面上的試劑盒產(chǎn)品絕大部分屬于直接法中的競(jìng)爭(zhēng)法。下面對(duì)直接法中的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法作重點(diǎn)說明。在進(jìn)行測(cè)定時(shí)首先將包被了抗體的酶標(biāo)板的微孔分為測(cè)定孔和對(duì)照孔，在對(duì)照孔中加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶

5、標(biāo)記物；在測(cè)定孔中同時(shí)加入酶標(biāo)記物和非酶標(biāo)抗原（通常來自于待測(cè)樣品），酶標(biāo)記物和樣品互相競(jìng)爭(zhēng)包被抗體的結(jié)合點(diǎn)，經(jīng)過溫浴后，沒有結(jié)合到包被抗體上的酶標(biāo)記物和樣品經(jīng)過洗滌去除。拍干后加入底物溶液，經(jīng)溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。其反應(yīng)原理如（圖2-18）所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本吸光度值的平均值（B ）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（O 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B 。）再乘以100 % ，即百分吸光度值。百分吸光度值（% ) = ( B / BO ) / 100 % 公式中B 為樣本溶液的平均吸光度值，B0為0PPb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以克倫特羅濃度的半對(duì)數(shù)值為x 軸，百分吸光度值為Y 軸，

6、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，（標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖一）相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中殘留的克倫特羅的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，在實(shí)際的計(jì)算中只需用酶標(biāo)測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光值，其他過程可通過專用的計(jì)算軟件完成。2、ELISA試劑的組成2.1、完整的ELISA試劑盒應(yīng)包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標(biāo)板）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記物）；（3）酶的底物；（4）系列參考標(biāo)準(zhǔn)品（定量測(cè)定）；（5）酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）反應(yīng)終止液。 2.2、ELISA試劑的作用2.2.1、固相載體：固相載體在ELISA測(cè)定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材

7、料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。2.2、免疫吸附劑：已包被抗原或抗體的固相載體，是ELISA方法中的核心試劑。2.3、酶標(biāo)記物：即酶標(biāo)記的抗原或抗體，是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的酶標(biāo)記物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。酶標(biāo)記物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在酶?biāo)記物中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外酶標(biāo)記物還要有良好的穩(wěn)定性。在ELISA中，常用

8、的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。2.4、酶的底物2.4.1、HRP的底物HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，最具代表性的過氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：DH2+ H2O2 = D+ 2H2O上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和AB

9、TS2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)。OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA

10、試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。TMB經(jīng)HRP作用后產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。2.4.2AP的底物AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收

11、峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。2.5、洗滌液洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。2.6酶反應(yīng)終止液常

12、用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。2.7參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定的ELISA試劑盒應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。3、ELISA實(shí)驗(yàn)過程3.1 試劑的準(zhǔn)備按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用蒸餾水或去離子水，。自配的緩沖液的PH應(yīng)用pH計(jì)進(jìn)行較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。3.2 加樣在ELISA實(shí)驗(yàn)中一般有5次加樣步聚，即加標(biāo)準(zhǔn)品、加樣本、加酶標(biāo)記物、加

13、底物、加反應(yīng)終止液。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。3.3 保溫在ELISA中一般加標(biāo)本和加酶標(biāo)記物后會(huì)有一次抗原抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。 ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸

14、。這是一個(gè)逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。為了便于操作目前絕大部分的試劑盒均采用室溫進(jìn)行溫育反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25，但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。3.4 洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。

15、通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作主要為浸泡式，過程如下： a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵

16、抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復(fù)操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。3.5 顯色和比色3.5.1、 顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。底物顯色一般在室外溫或37反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，約40分鐘將達(dá)到顯色的頂峰，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。產(chǎn)物用各類酸性終止液終止后會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可

17、用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值。3.5.2 比色比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫于A字母的右下角，如TMB的吸收波長(zhǎng)為450nm，表示方法為"A450nm"或"OD450nm"。3.6.3 酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指專用于測(cè)讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。許多試劑公司配套

18、供應(yīng)酶標(biāo)儀。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。舉例說，若某孔測(cè)得的A值為1.083，則該孔相對(duì)于空氣的真實(shí)A值應(yīng)為1.083±0.01（1.0731.093），重復(fù)測(cè)定數(shù)次，其A值均應(yīng)1.083±0.05（1.0781.088）在之間。酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。酶標(biāo)儀的檢測(cè)范圍一般在0.0003.000之間，甚至更高。超出可測(cè)上限的A值常以"*"或"over"或其它符號(hào)表示。酶標(biāo)儀不應(yīng)安

19、置在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在1530，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，用單波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)讀。也可用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)讀，即每孔先后測(cè)讀兩次，第一次在最適波長(zhǎng)（W1），第二次在不敏感波長(zhǎng)（W2），兩次測(cè)定間不移動(dòng)ELISA板的位置。例如TMB用450nm為W1，625nm為W2，最終測(cè)得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀使用說明書。4.ELISA試驗(yàn)的質(zhì)量控制4.1、分析前質(zhì)控4.1.1、人員培訓(xùn) 實(shí)驗(yàn)人員操作的技巧及熟練程度直接影響到檢驗(yàn)結(jié)果，

20、因此檢驗(yàn)人員需經(jīng)過培訓(xùn)，熟練掌握相關(guān)的技術(shù)知識(shí)和操作要點(diǎn)：檢驗(yàn)項(xiàng)目的基本原理 （ELISA原理）；熟悉檢測(cè)技巧，了解實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及操作要點(diǎn)；熟悉檢測(cè)試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成）；4.1.2、儀器質(zhì)控 為使儀器保持最佳工作狀態(tài)應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。移液器：ELISA加樣量?。?-100l），其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計(jì)算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在±2%以內(nèi)；水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計(jì)所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實(shí)測(cè)溫度是否一致

21、，允許有±1的誤差；洗板機(jī)：每個(gè)廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ，人工扣板時(shí)，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測(cè)校正，使其保持良好的工作性能。4.1.3、標(biāo)本采集及處理過程的質(zhì)控取樣：保證取樣有代表性，即要遵循一定的取樣方法又要保證一定的取樣比例（如：隨機(jī)多點(diǎn)取樣、四分法等）樣品選取過程中需要避免產(chǎn)生交叉污染。如：處理不同批次的樣品時(shí)應(yīng)更換使用的工器具或?qū)κ褂玫墓ぞ哌M(jìn)行徹底的清洗。4.2、分析中質(zhì)控ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果受操作影響很大，每個(gè)步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的

22、高靈敏，強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)。因此,應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)。加樣加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板的底部避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣槍的槍頭不要觸及微孔的內(nèi)壁。每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一樣一吸頭，以免發(fā)生交叉污染。溫育大多數(shù)的試劑盒抗原抗體反應(yīng)需要在室溫度下，經(jīng)過一定的時(shí)間才能達(dá)到反應(yīng)的平衡點(diǎn)ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能   使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。邊緣效應(yīng)（2ng/mlHBsAg一步法三種不同溫育法的

23、結(jié)果）洗滌ELISA是靠洗滌來達(dá)到分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及酶標(biāo)記物的目的，同時(shí)洗滌也可將非特異吸附的蛋白質(zhì)的干擾以及血球、細(xì)菌中的酶干擾清除掉。手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內(nèi)反應(yīng)液；              2）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即甩去）；              3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖

24、動(dòng)；              4）甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。           重復(fù)以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平，使洗板機(jī)上的每個(gè)放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時(shí)要設(shè)置一定的浸泡時(shí)間。如出現(xiàn)機(jī)洗后拍板有較多殘留液時(shí)應(yīng)再用手工洗2次以上。關(guān)機(jī)前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。顯色HR

25、P催化底物是一步呈色反應(yīng)，同樣需要一定的時(shí)間和溫度，一定要按照說明書規(guī)定的時(shí)間溫度（一般為室溫°C，15-20分鐘）。達(dá)到規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間后需要立即終止。酶標(biāo)儀判讀結(jié)果顯色反應(yīng)終止后應(yīng)立刻比色（一般在30分鐘內(nèi)有效）。 常見的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者最為常見，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。  TMB終止后顯黃色，測(cè)定波長(zhǎng)為450nm， 參比波長(zhǎng)為630nm。       使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)要注意反應(yīng)孔底部應(yīng)用紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中

26、比色，否則吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片。4.3、幾種常用的質(zhì)控方法4.3.1、灰區(qū)概念   把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下的一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換試劑重測(cè)以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)則報(bào)告+（陽性）。   灰區(qū)的設(shè)置方法為：C.O×（1±CV）CV為該試劑的批內(nèi)CV  (一般為510%）；4.3.2、外添加回收率試驗(yàn)方法A、什么是外添加回收率外添加回收率是指向陰性樣中加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使之達(dá)到某一確定濃度（稱為加標(biāo)樣），然后將其與該陰性樣同時(shí)測(cè)定，進(jìn)行對(duì)照試

27、驗(yàn)，以觀察加入的標(biāo)準(zhǔn)品的量能否定量回收，以回收率表示。B、如何添加標(biāo)準(zhǔn)品原則上我們建議使用較高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行外添加，下面以我公司的試劑盒為例進(jìn)行說明：假設(shè)使用4.05ppb標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加，一般魚肉的檢測(cè)下限為0.1ppb，建議將魚肉添加到0.1ppb作為回收樣品進(jìn)行檢測(cè)。所以假設(shè)需要添加X ml 4.05ppb的標(biāo)準(zhǔn)品于1克魚肉中，得到0.1ppb的魚肉樣本。按公式(1)計(jì)算X值（1+X）0.1=4.05X (1)則X即為所添加的4.05PPb標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。C、如何計(jì)算回收率添加前的陰性魚肉設(shè)為樣品A，添加后的魚肉設(shè)為樣品B，將A和B同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果分別為CA、CB，按公式(2)進(jìn)行計(jì)算回收率回收率=（CB CA）/0.1×100% (2)D、外添加回收率的意義。外添加回收率的意義在于，通過外添加一定已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，從而驗(yàn)證試驗(yàn)方法的穩(wěn)定性和有效性。4.3.3、用確證樣品質(zhì)控選取與被測(cè)樣本性質(zhì)接近的經(jīng)過確證的樣本為質(zhì)控樣本，在每次進(jìn)行檢測(cè)時(shí)將該樣本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，通過判斷該樣品檢出值與確證值之間的變異度來判斷檢驗(yàn)結(jié)果的有效性。4.3.4、室間質(zhì)評(píng)的方法 ：發(fā)質(zhì)控物進(jìn)行調(diào)查 這是國內(nèi)外室間質(zhì)評(píng)的常用形式。有關(guān)管理部門或相關(guān)的行業(yè)檢驗(yàn)協(xié)會(huì)采用定期發(fā)放質(zhì)控物至各實(shí)驗(yàn)室，各實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定的日期進(jìn)行檢驗(yàn)，并將檢