組織因子途徑抑制物的生理功能及臨床應(yīng)用價值

1、組織因子途徑抑制物的生理功能及臨床應(yīng)用價值         【摘要】  組織因子途徑抑制物（TFPI）是組織因子、因子和因子的天然抑制物，在維持正常凝血中發(fā)揮關(guān)鍵的生理作用。近年來，隨著對TFPI結(jié)構(gòu)與功能研究的深化，發(fā)現(xiàn)它還能抗炎癥和誘導(dǎo)凋亡，并在動脈粥樣硬化、敗血癥和惡性腫瘤等疾病的治療上有重要的應(yīng)用價值。本文將對TFPI的生理作用和臨床應(yīng)用前景進行綜述。【關(guān)鍵詞】  組織因子途徑抑制物；結(jié)構(gòu)；功能；生理作用；臨床應(yīng)用  Physiological functions a

2、nd applications of tissue factor pathway inhibitor【Abstract】  Tissue factor pathway inhibitor (TFPI)，the inherent inhibitor of tissue factor (TF) and factors and ，is a key molecule that plays a regulatory role in the physiological coagulation.Peoples knowledge on its structure and functions has

3、 been intensively enlarged in recent years.Besides the functions of anti-inflammation and introducing apoptosis，it was also found that TFPI could be served as medicine in treating some diseases such as atherosclerosis，sepsis and malignancy.This paper is a review mainly on the physiological functions

4、 and applications of TFPI.【Key words】  TFPI; structure; function; physiological effect; application   組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）是外源性凝血途徑的天然抑制物。該因子早在20世紀初就被發(fā)現(xiàn)，但直到上世紀80年代，人們才對其展開深入系統(tǒng)的研究。1983年，Sander等首先闡明了TFPI抑制外源性凝血途徑的機制。1988年，Wun等首次克隆TFPI的cDNA，并據(jù)此推斷出它的氨基酸組成和空間構(gòu)型，將其

5、隸屬于Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制物家族。1990年后，人們先后對TFPI的基因定位、表達調(diào)控、分子生物學(xué)特性、基因工程表達、其他生理學(xué)功能，以及一系列疾病的治療作用進行了研究，獲得了許多重要進展。TFPI以其重要的生理學(xué)意義和對重大疾病的治療價值，吸引著人們對它的進一步關(guān)注。1  TFPI 基因和蛋白的結(jié)構(gòu)特點1.1  TFPI的基因結(jié)構(gòu)與定位  TFPI基因全長約86kb，定位于 2q312q32.1，由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成。其中外顯子1和2編碼 TFPI mRNA 的5端非翻譯區(qū)，外顯子3編碼信號肽及N末端，外顯子4、6、8分別編碼TFPI的K1、K

6、2和K3結(jié)構(gòu)域，外顯子5和7編碼K1、K2和K3之間的兩段連接區(qū)，外顯子9編碼C末端和3端非翻譯區(qū)。由于剪切形式的不同，TFPI 基因在轉(zhuǎn)錄后形成 4kb 和 1.6kb 2種mRNA，后者缺乏外顯子2（約2.6kb）。TFPI基因的上游調(diào)控區(qū)缺少TATA盒和GATA盒，它的轉(zhuǎn)錄主要受GATA元件的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子GATA-2與TFPI表達呈明顯相關(guān)性1。1.2  TFPI的蛋白結(jié)構(gòu)  TFPI 是一種全長由276個氨基酸殘基組成的耐熱單鏈糖蛋白，含K1、K2和K3三個Kunitz結(jié)構(gòu)域，另外還包括2個連接區(qū)以及一個富含酸性氨基酸的N末端和一個富含堿性氨基酸的C末端。TFPI

7、的空間結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，所含18個半胱氨酸殘基構(gòu)成9對二硫鍵，參與維持其二級結(jié)構(gòu)，此外該蛋白還在117、167和228位的N原子上有糖基化修飾。結(jié)構(gòu)域K1和K2是 TFPI 發(fā)揮抗凝活性的關(guān)鍵部位，K3在該作用中并非必需，但它的存在可以使 TFPI 更好地抑制凝血。近年來有不少研究表明，K3和C末端可以和肝素、膜表面糖蛋白及多糖結(jié)合2，另外該區(qū)域還與 TFPI 的抗炎作用有關(guān)。糖基化修飾幾乎與 TFPI 生物活性無關(guān)。2  TFPI的生理功能生理條件下，TFPI主要由微血管內(nèi)皮細胞合成，大部分錨著于內(nèi)皮細胞，少量以游離形式存在，或者與脂蛋白、血小板結(jié)合后進入血流循環(huán)。TFPI的恒定表達對

8、于內(nèi)皮細胞的抗凝血功能及維持血液的正常流動非常重要。 經(jīng)典凝血理論將凝血途徑分為外源性凝血途徑和內(nèi)源性凝血途徑，其中外源性凝血途徑是生理性止血的主要途徑。血管內(nèi)皮細胞受損時，內(nèi)皮下細胞表面的組織因子（tissue factor，TF）暴露于血液，外源性凝血途徑立即啟動。TF與血液中少量的F（Fa）結(jié)合，形成Fa/TF復(fù)合物，而后活化F和少量F，活化的F（Fa）激活凝血酶原變?yōu)槟?，從而引起凝血，少量Fa對F的激活則產(chǎn)生放大作用。但是，2004年 Genmin Lu 等人通過反應(yīng)動力學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，生理條件下 a/TF 活化的產(chǎn)物中，F(xiàn)a 的活性明顯超過 Fa 的活性，進而提出外源性凝血途徑的早期

9、是以 F 活化為主，而 Fa 則更傾向于是Fa 的活化產(chǎn)物3。TFPI 是外源性凝血途徑中主要的抑制因子，其抑制作用是分兩步實現(xiàn)的：首先，TFPI 通過K2與活化的 F 結(jié)合，并競爭性地抑制其活性，該過程是一個 Ca2+非依賴的可逆性過程；然后，F(xiàn)a/TFPI 復(fù)合物中的 TFPI 通過 K1 與Fa/TF 復(fù)合物中的 Fa 活性部位結(jié)合，從而實現(xiàn)對 Fa/TF 復(fù)合物的抑制。Fa 輕鏈中谷氨酸殘基上的-羧基與Ca2+結(jié)合，并通過“鈣橋”結(jié)合于Fa/Fa/TF 復(fù)合物中 TF 附近的磷脂表面，使得 Fa/TFPI 與 a/TF 形成穩(wěn)固的 Fa/TFPI/a/TF 四元復(fù)合物，該復(fù)合物可以被單

10、核細胞和內(nèi)皮細胞等吞噬清除。TFPI 和抗凝血酶（anti-thrombin ，AT）都能與 Fa 結(jié)合并抑制后者的活性。AT 對 Fa 的抑制是不可逆的。當外源性凝血途徑激活后，產(chǎn)生大量的 Fa，AT 快速與 Fa 結(jié)合并顯著地抑制其活性3，所形成的復(fù)合物最后被清除。TFPI 與 Fa 的結(jié)合是一個可逆過程，兩者結(jié)合后一部分 Fa 的活性受到抑制。更重要的是，F(xiàn)a/TFPI 復(fù)合物能在外源性凝血途徑活化的起始階段對 a/TF 進行抑制，從而在根本上阻斷 F 和 F 的大量活化，避免了凝血因子及 AT 等抑制因子的大量消耗。由此可見，TFPI 在外源性凝血途徑的負反饋調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。

11、3  TFPI 的抗炎功能感染性疾病患者常出現(xiàn)血液的高凝狀態(tài)。炎癥反應(yīng)與凝血反應(yīng)之間顯然存在著某些聯(lián)系。近年來發(fā)現(xiàn)，細菌及其釋放的內(nèi)毒素一方面刺激某些炎癥細胞產(chǎn)生大量的前炎癥細胞因子，如 IFN-、IL-1 和 TNF- 等，它們均能刺激內(nèi)皮細胞和單核細胞高度表達 TF；另一方面，細菌或內(nèi)毒素也能直接刺激內(nèi)皮細胞和單核細胞表達 TF。Fa 和凝血酶也能刺激激活的單核細胞和內(nèi)皮細胞，合成并釋放 IL-6、IL-8 和其他炎癥反應(yīng)因子，這些炎癥因子又通過自分泌或旁分泌的形式，促使 TF 在這些細胞中高表達4，5?？梢娧装Y與凝血是一種相互促進、相互惡化的關(guān)系。炎癥反應(yīng)主要通過外源性凝血途徑

12、引起血液高凝。TFPI 能從 Fa 和 TF水平阻斷炎癥反應(yīng)與凝血反應(yīng)之間的惡性循環(huán)，同時發(fā)揮抗凝抗炎的作用。動物實驗發(fā)現(xiàn)，靜脈注入外源性 TFPI，可以降低血漿中 IL-6 和 IL-8 等炎癥因子的水平，動物的存活率或存活時間都有所改善6。TFPI 也具有直接的抗炎癥作用。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）進入體內(nèi)引起炎癥反應(yīng)時需要有脂多糖結(jié)合蛋白（LPS binding protein，LBP）的存在。LBP 不僅介導(dǎo) LPS 與 CD14 結(jié)合，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，而且還能增加單核細胞及分葉細胞對 LPS 的敏感性。TFPI 可以干擾 LPS 與 LBP 的結(jié)合，或者通過

13、其K3 及 C 末端與 LPS 直接結(jié)合，競爭性抑制 LPS 與 LBP 的結(jié)合7，最終發(fā)揮抗炎作用。4  TFPI 與細胞凋亡和增殖Tsutomu Hamuro 首次發(fā)現(xiàn) TFPI 可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生凋亡8。目前認為 TFPI 誘導(dǎo)凋亡的結(jié)構(gòu)主要集中在 C 末端，與其抗凝作用無關(guān)。TFPI 誘導(dǎo)凋亡可能與極低密度脂蛋白（VLDL）受體有關(guān)，但僅有 TFPI 與 VLDL 受體結(jié)合并不足以啟動細胞凋亡，因此推測還有其他分子在起作用9。此外，有研究發(fā)現(xiàn) TFPI 的 C 末端能抑制平滑肌細胞的增殖10，其機制尚不清楚。TFPI誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡和抑制平滑肌細胞增殖對血管形成是一種負

14、調(diào)節(jié)，有可能是其抑制腫瘤生長的機制之一。5  TFPI的應(yīng)用價值5.1  TFPI與動脈粥樣硬化  TF 的暴露或高表達與許多血栓性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中，對動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的研究較多。在AS患者增厚的內(nèi)膜、斑塊部位的間質(zhì)和細胞都能檢測到 TF 的高表達，而且越靠近斑塊脂質(zhì)核心 TF 表達水平越高。作為對 TF 升高的一種代償性調(diào)節(jié)，TFPI 在 AS 中表達水平也是升高的，它和 TF 同時出現(xiàn)在斑塊區(qū)內(nèi)皮細胞、壞死區(qū)周圍的巨噬細胞和平滑肌細胞中，但 TFPI 的數(shù)量遠遠達不到抑制 TF 的水平。一旦斑塊破裂，大量 TF

15、暴露并激活外源性凝血途徑，最終在局部形成血栓，是引起急性冠脈綜合征或腦梗死根本原因。臨床觀察發(fā)現(xiàn) TF 與急性心肌梗死和不穩(wěn)定性心絞痛有明顯的相關(guān)性11，因此抑制 TF 活性對 AS 及急性冠脈綜合征的防治有著重要的意義。Badimon 等通過離體實驗發(fā)現(xiàn)，重組 TFPI 能顯著降低血小板及纖維蛋白在斑塊破裂部位的沉積12，證實了 TFPI 在治療 AS 中的有效性，動物實驗也顯示出同樣的效果。除了容易形成血栓外，內(nèi)膜增生也是 AS 發(fā)病過程中的一個重要方面。內(nèi)膜過度增生所導(dǎo)致的遠端供血不足是不穩(wěn)定性心絞痛發(fā)作的重要原因。Pierre 等人將 TFPI 基因局部轉(zhuǎn)染到經(jīng)球囊損傷的 AS 血管，

16、發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增生受到明顯抑制13。因此，TFPI 的抗凝及抑制內(nèi)膜增生的作用可能在 AS 和冠脈綜合征的治療中發(fā)揮作用。5.2  TFPI與深靜脈血栓  手術(shù)過程中對組織的損傷使大量的TF暴露于血液，容易形成高凝狀態(tài)或急性血栓。Dahm 等發(fā)現(xiàn)游離型和總TFPI的減少是深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）的危險因素14。TF與TFPI之間的失衡，即TFPI對外源性凝血的調(diào)控不足是DVT發(fā)生的重要原因。重組人TFPI1-161（即缺乏K3和C末端的TFPI）在治療兔頸靜脈血栓時，有著與肝素同樣的效力，但出血等不良反應(yīng)明顯減少15。因此，TFPI

17、有可能取代肝素應(yīng)用于術(shù)后DVT的預(yù)防和治療。5.3  TFPI與感染性疾病  血液高凝狀態(tài)與炎癥反應(yīng)是感染性疾病的兩大病理特征，常導(dǎo)致病情惡化甚至引發(fā)多功能臟器衰竭，從而直接威脅患者的生命，因此抗凝抗炎在嚴重感染性疾病的治療中越來越受到人們的重視。動物實驗發(fā)現(xiàn)，TFPI 能夠顯著改善嚴重感染動物的癥狀并提高其存活率6，16。國外對重組人TFPI（recombinant TFPI，rTFPI）治療敗血癥（sepsis）進行了一系列的臨床研究。期臨床試驗證實健康志愿者在接受 rTFPI 注射后表現(xiàn)出很好的耐受性，期臨床試驗中治療組 28 天死亡率相對安慰劑組降低約 20%，同時

18、也顯示出一定的抗炎作用。盡管期臨床試驗的結(jié)果不如期理想，但仍發(fā)現(xiàn) rTFPI 能顯著降低輕度敗血癥患者28天的死亡率（12% vs 22.9%）。目前對 rTFPI 治療敗血癥的期臨床試驗方案的設(shè)計存在爭議，因此 rTFPI 在敗血癥治療中的作用有待于進一步研究17。         社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）是一種多發(fā)性感染性疾病，盡管使用了足量的抗生素，但病情嚴重的患者死亡率仍然很高。TF 在肺部的高表達與高凝狀態(tài)及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，因此 TFPI 有望成

19、為控制嚴重肺炎的藥物。目前，由 Chiron 公司推出的 rTFPI 治療嚴重社區(qū)獲得性肺炎的 期臨床試驗正在進行當中18。5.4  TFPI與惡性腫瘤  許多惡性腫瘤，如結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、胰癌等，都伴有不同程度的凝血功能紊亂，該現(xiàn)象稱為特魯索綜合征（Trousseau syndrome），發(fā)生機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細胞表面都有 TF 的高表達，因此有學(xué)者推測可能是腫瘤細胞膜表面的 TF 脫落到血液中，引起患者出現(xiàn)高凝狀態(tài)。TF 不僅與惡性腫瘤的高凝有關(guān)，它還可以作為膜表面的受體分子與其配體 Fa 結(jié)合，引起細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致腫瘤細胞的行為發(fā)生改變1

20、9。有研究表明 TF 可以促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成，而這種效應(yīng)與凝血作用無關(guān)。TFPI 同樣也可以抑制由 TF/Fa 引起的非凝血效應(yīng)。Todd 給接種了黑色素瘤細胞的老鼠注入人 TFPI，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長、血管生成受到明顯抑制20。此外，Amirkhosravi 用老鼠動物模型證實皮下注射鼠源 TFPI 可以顯著抑制黑色素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移；將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 TFPI 基因的黑色素瘤細胞注入老鼠后，其侵襲性明顯下降21。隨著 TF 和 TFPI 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機制日見闡明，TFPI 有可能在將來的腫瘤治療中發(fā)揮一定的作用。5.5  TFPI 與其他疾病  有學(xué)者發(fā)現(xiàn)特異性肺間

21、質(zhì)纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）患者的支氣管肺泡灌洗液中存在大量的TF和TFPI，而且它們的水平與 IPF 病情呈正相關(guān)。免疫組織化學(xué)顯示TF和TFPI在增生的立方形柱狀上皮細胞上有高表達，但它們之間的不平衡促使局部形成高凝環(huán)境，從而導(dǎo)致纖維蛋白在肺間質(zhì)的沉積22。成人呼吸窘迫綜合征（adult respiratory distress syndrome，ARDS）是另一種與纖維蛋白在肺部沉積相關(guān)的疾病，研究發(fā)現(xiàn)TF在該疾病中同樣有高表達，而TFPI水平正常或輕度升高，TFPI對TF的調(diào)控不足可能與ARDS的發(fā)展有關(guān)23。另外，還發(fā)現(xiàn) TFPI 在

22、腎病綜合征、1型糖尿病早期患者的血漿中有較高水平；胎盤早剝的子宮肌層、胎盤24也有較高水平的TF及TFPI表達；系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白塞氏病血漿中游離型和總 TFPI 均降低。TF與TFPI水平的變化可能為這些疾病的診斷和治療提供一些有用的依據(jù)。6  展望在對 TFPI 生理學(xué)基礎(chǔ)及分子生物學(xué)特性有了深度認識的今天，人們逐步將研究的重點轉(zhuǎn)移到該分子與臨床疾病的關(guān)系上。許多疾病與 TFPI 表達降低或缺少有關(guān)，加入外源性 TFPI 可以不同程度地改善疾病狀況。其中，在血栓性疾病、感染性疾病治療和血管再狹窄的預(yù)防等方面已有大量的動物實驗甚至臨床試驗，因此 TFPI 也正在向臨床新藥的方向快速

23、發(fā)展。盡管目前人們已經(jīng)可以通過基因工程的方法獲得大量重組的人TFPI，但是過短的半衰期成為臨床應(yīng)用的瓶頸。近期，我們實驗室研制的重組長效TFPI已獲成功25，該突變體的半衰期為野生型的4倍，有望為 TFPI 的臨床應(yīng)用提供更加廣闊的空間?！緟⒖嘉墨I】1  Bajaj MS，Tyson DR，Steer SA，et al.Role of GATA motifs in tissue factor pathway inhibitor gene expression in malignant cells.Thromb Res，2001，101(3)：203-211.2  Piro

24、O，Broze GJ Jr.Role for the Kunitz-3 domain of tissue factor pathway inhibitor-alpha in cell surface binding circulation.Circulation，2004，110(23)：3567-3572.3  Genmin Lu，George J Broze，Jr Sriram Krishnaswamy. Formation of factors IXa and Xa by the extrinsic pathway：differential regulation by tiss

25、ue factor pathway inhibitor and antithrombin III.J Biol Chem，2004，279(17)：17241-17249.4  Hans Tapper，Heiko Herwald. Modulation of hemostatic mechanisms in bacterial infectious diseases.Blood，2000，96(7)：2329-2337.5  Hugo ten Cate.Pathophysiology of disseminated intravascular coagulation in

26、sepsis.Crit Care Med，2000，28(9 Suppl)：S9-11.6  Matyal R，Vin Y，Delude RL，et al.Extremely low doses of tissue factor pathway inhibitor decrease mortality in a rabbit model of septic shock.Intensive Care Med，2001，27(8)：1274-1280.7  Park CT，Creasey AA，Wright SD.Tissue factor pathway inhibitor blocks cellular effects of endotoxin by binding to endotoxin and interfering with transfer to CD14.Blood，1997，89(12)：4268-4274.8  Tsutomu Hamuro，Yu-ichi Kamikubo，Yo Nakahara，et al.Human recombinant tissue factor pathway inhibitor induces apoptosis in cultured hum