SD大鼠脊髓中NT-3及其受體TrkC的原位分布

1、 11-02-17 10:11:00 編輯：studa090420 作者：錢東翔 張洪鈿 羅鵬 郭煒 王智堅 李珺 秦玲莎 【摘要】目的 通過免疫組化染色的方法研究成年SD大鼠脊髓中NT-3及其受體TrkC的原位分布和亞細(xì)胞定位，探討內(nèi)源性NT-3的作用機(jī)制。方法 以健康成年SD大鼠為實驗動物，取脊髓各節(jié)段的運動神經(jīng)元組織標(biāo)本作免疫組化染色，以了解NT-3及TrkC的原位分布和亞細(xì)胞定位。結(jié)果 觀察到不同強(qiáng)度的NT-3及TrkC免疫陽性產(chǎn)物廣泛分布于大鼠脊髓的運動神經(jīng)元、中間神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。NT-3定位于胞漿和胞核，胞核染色明顯，強(qiáng)于胞漿和神經(jīng)纖維。TrkC主要定位于陽性細(xì)胞的胞漿內(nèi)，極少出

2、現(xiàn)在樹突或神經(jīng)末梢上。結(jié)論 NT-3及TrkC在成年SD大鼠脊髓的運動神經(jīng)元有差異性表達(dá)，提示二者均參與了大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的生理功能，但在不同區(qū)域又發(fā)揮著不同的作用。 【關(guān)鍵字】神經(jīng)營養(yǎng)因子 NT-3 TrkC 免疫組織化學(xué) 分布 神經(jīng)營養(yǎng)因子（Neurotrophic factors ,NTFs）是能促進(jìn)神經(jīng)元存活，誘導(dǎo)其分化，并對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及功能的維持起作用的一類多肽1。至今，已發(fā)現(xiàn)的NTFs不下20余種。NT-3是迄今為止發(fā)現(xiàn)的，在動物發(fā)育過程中表達(dá)最強(qiáng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子2。NTFs的成員不僅可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活，刺激軸突生長，調(diào)節(jié)突軸可塑性和神經(jīng)傳遞，在神經(jīng)細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化及功能維

3、持中發(fā)揮作用，而且可以促進(jìn)損傷神經(jīng)元的修復(fù)和再生，從而減輕腦或脊髓損傷后繼發(fā)性損害的程度，因此在神經(jīng)損傷修復(fù)過程中起著重要作用3-6。所以，各國神經(jīng)科學(xué)家在這一領(lǐng)域廣泛地開展研究。即便如此，在體內(nèi)，內(nèi)源性的NT-3在不同種類的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮怎樣的生理作用及其作用模式目前尚不清楚。絕大多數(shù)是NTFs參與神經(jīng)組織損傷的相關(guān)性研究，例如應(yīng)用外源性NTFs促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)等，而要澄清NTFs在CNS不同部位、不同神經(jīng)元群間的轉(zhuǎn)運模式和作用機(jī)制，必須深入了解NTFs蛋白在CNS的區(qū)域分布和亞細(xì)胞定位。本實驗擬通過免疫組化染色的方法研究成年SD大鼠脊髓運動神經(jīng)元中NT-3的原位分布和亞細(xì)胞定位，探討內(nèi)源性N

4、T-3的作用機(jī)制。 1 材料與方法 1.1實驗動物 實驗用SD大鼠，體重200220克，微生物等級為SPF級，均為雌性，飼養(yǎng)溫度2024，正常飲食，自由飲水。購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，經(jīng)廣東省實驗動物監(jiān)測所檢驗檢疫符合實驗動物標(biāo)準(zhǔn)，許可證號為：SCXK(粵)20030002 粵監(jiān)證字2008A020。 1.2實驗試劑 兔抗NT-3多克隆抗體（Millipore，效價1:1000）、鼠抗TrkC單克隆抗體（Millipore，效價1:3000）、SP三步法試劑合、濃縮型DAB 試劑合、熒光二抗試劑、免疫組化常規(guī)試劑等。 1.3免疫組化取材 將待取材大鼠過量麻醉，用4%多聚甲醛心內(nèi)灌注固定，取雙

5、側(cè)頸髓、胸髓、腰髓三個部位的各兩小節(jié)段脊髓組織。后固定后作梯度濃度蔗糖脫水，再作連續(xù)切片制作標(biāo)本玻片，用NT-3及TrkC抗體行免疫組織化學(xué)染色。 2 結(jié)果 2.1 NT-3在SD大鼠脊髓中的分布及亞細(xì)胞定位 2.1.1脊髓灰質(zhì) 在脊髓灰質(zhì)腹角，可見NT-3免疫陽性神經(jīng)元，以大運動神經(jīng)元為主，特別是、IX板層染色明顯（圖1）。在灰質(zhì)背角的、板層，可見毛刷狀的NT-3免疫陽性神經(jīng)元，但染色較弱。在中央管附近的Clarke核（Clarke nucleus，CN）可見NT-3強(qiáng)陽性染色的神經(jīng)元。 圖1 NT-3在正常成年SD大鼠脊髓腹角陽性運動神經(jīng)元的免疫組化染色200 2.1.2脊髓白質(zhì) 在整個白

6、質(zhì)區(qū)的橫斷面上，可見弱陽性的NT-3免疫陽性纖維和細(xì)胞，從形態(tài)上判斷，細(xì)胞形似星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。 2.1.3亞細(xì)胞定位 在胞漿和胞核均可觀察到NT-3免疫陽性產(chǎn)物，胞核染色非常明顯，比胞漿染色更強(qiáng)，少量陽性神經(jīng)纖維著色。 2.2 TrkC在SD大鼠脊髓中的分布及亞細(xì)胞定位 在正常的脊髓中，TrkC的免疫陽性產(chǎn)物被檢測到在運動神經(jīng)元和中間神經(jīng)元中均有表達(dá)。TrkC的亞細(xì)胞定位主要是位于陽性細(xì)胞的胞漿內(nèi)，極少出現(xiàn)在樹突或神經(jīng)末梢上（圖2）。在白質(zhì)內(nèi)被GFAP標(biāo)記的星型膠質(zhì)細(xì)胞也同樣可見TrkC抗體的陽性表達(dá)。 圖2 TrkC在正常成年SD大鼠脊髓前角運動神經(jīng)元的免疫組化染色300 11-0

7、2-17 10:11:00 編輯：studa090420 3 討論 在本研究中，我們觀察到NT-3及其受體TrkC均在脊髓腹角運動神經(jīng)元有所表達(dá)，說明正常情況下提示二者有協(xié)同維持神經(jīng)元存活的作用。NT-3陽性免疫產(chǎn)物見于脊髓背角板層的Lissauers束，提示NT-3可由脊神經(jīng)的假單極神經(jīng)元合成，通過軸突轉(zhuǎn)運，輸送到脊髓背角板層以維持板層內(nèi)感覺神經(jīng)元的存活。 在中央管附近的Clarke核（Clarke nucleus，CN）可見NT-3強(qiáng)陽性染色的神經(jīng)元，Novikova等7發(fā)現(xiàn)大鼠頸髓損傷后，雖然Clarke核神經(jīng)元同時表達(dá)TrkC和TrkB受體，但僅有NT-3具有神經(jīng)保護(hù)活性：即鞘內(nèi)注射N

8、T-3后，Clarke核神經(jīng)元的存活率從60升高到91%，而聯(lián)合運用BDNF和NT-3后，NT-3對CN的保護(hù)作用則不復(fù)存在，表明：外源性的NT-3對Clarke核有良好的保護(hù)作用，我們的研究在體內(nèi)更進(jìn)一步證實了這一結(jié)果。 NT-3和TrkC在正常脊髓細(xì)胞的亞細(xì)胞定位有所不同。NT-3免疫陽性產(chǎn)物主要分布于核內(nèi)，胞漿和突起的染色相對較淺，以大運動神經(jīng)元為主，特別是、板層染色明顯。在灰質(zhì)背角的、板層，可見毛刷狀的NT-3免疫陽性神經(jīng)元，但染色較弱。在中央管附近的Clarke核可見NT-3強(qiáng)陽性染色的神經(jīng)元。而TrkC在運動神經(jīng)元和中間神經(jīng)元中均有表達(dá)，TrkC的亞細(xì)胞定位主要是位于陽性細(xì)胞的胞漿

9、內(nèi)，極少出現(xiàn)在樹突或神經(jīng)末梢上。在白質(zhì)內(nèi)被GFAP標(biāo)記的星型膠質(zhì)細(xì)胞也同樣可見TrkC抗體的陽性表達(dá)。NT-3的受體有兩類，膜受體和核受體，前者位于細(xì)胞膜，后者位于細(xì)胞核，核受體的存在為NT-3進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用提供了可能。 顧玲等人8的研究表明：TrkC的免疫陽性反應(yīng)物可見于脊髓灰質(zhì)腹角的運動神經(jīng)元，而已有研究發(fā)現(xiàn)脊髓運動神經(jīng)元和其靶組織均表達(dá)NT-3 mRNA9，10，結(jié)合我們對NT-3蛋白表達(dá)的研究，提示腹角運動神經(jīng)元可自主合成NT-3，但也可通過攝取方式獲得NT-3，而且NT-3在脊髓前角運動細(xì)胞可能存在自分泌旁分泌的作用模式。在脊髓背角，淺層陽性細(xì)胞少見，但板層可見TrkC陽性染色明顯

10、深于其他層。我們也在背角板層發(fā)現(xiàn)NT-3陽性膨體，進(jìn)而提示，板層是NT-3的作用位點，TrkC可能與這些部位的NT-3發(fā)揮作用有關(guān)。 參 考 文 獻(xiàn) 1Levi-Montalcini R. The nerve growth factor : thirty-five years later. Science, 1987, 237: 1154-l164. 2Maisonpierre PC, Belluscio L, Friedman B, et al. NT-3, BDNF and NGF in the developing rat nervous system:Parallel as well

11、as reciprocal patterns of expression. Neuron, 1990,5:501-509. 3Sharma HS.Post-traumatic application of brain-derived neurontrophic factor and glia-derived neurotrophic factor on the rat spinal cord enhances neuroprotection and improves motor function. Acta Neurochir Suppl，2006，96: 329-34. 4Shumsky J

12、S, Tobias CA, Tumolo M, et al. Delayed transplantation of fibroblasts genetically modified to secrete BDNF and NT-3 into a spinal cord injury site is associated with limited recovery of function. Exp Neurol，2003，184(1): 114-30. 5 Hung KS, Tsai SH, Lee TC, et al. Gene transfer of insulin-like growth

13、factor-I providing neuroprotection after spinal cord injury in rats. J Neurosurg Spine，2007，6(1):35-46. 6Yan J, Xu L, Welsh AM, Hatfield G, et al. Extensive Neuronal Differentiation of Human Neural Stem Cell Grafts in Adult Rat Spinal Cord. PLoS Med，2007，4(2): 39. 7Novikova LN, Novikov LN, Kellerth JO, et al. BDNF abolishes the survival effect of NT-3 in axotomized Clarke neurons of adult rats. J comp Neurol,2000,428(4):671-680. 8顧玲，高玉陪，唐太昆，等.TrkC在成年貓脊髓和背根節(jié)的分布.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000,21(l):34-36. 9Ernfors P，Wetmore C, Olson L, et al. Identification of cells in rat brain and peripheral tissues