STP-VD-9401-01 頭孢克肟分散片微生物限度驗(yàn)證方

1、頭孢克肟分散片微生物限度檢查法驗(yàn)證方案文件編號(hào)：批準(zhǔn)日期： ： 驗(yàn)證方案名稱驗(yàn)證編號(hào)頭孢克肟分散片微生物限度檢查法驗(yàn)證方案STP-VD-9401-01起草人部門起草日期  審核人部門審核日期  批準(zhǔn)人部門批準(zhǔn)日期驗(yàn)證小組成員名單組 長(zhǎng)姓名職務(wù)/職稱部門何鋒經(jīng)理質(zhì)量部成 員姓名職務(wù)/職稱部門陳嬈QC主管質(zhì)量部康清勇QA主管質(zhì)量部鐘元芳QC質(zhì)量部頭孢克肟分散片微生物限度檢查驗(yàn)證方案目錄1概述2目的3范圍4驗(yàn)證程序5再驗(yàn)證6結(jié)果評(píng)價(jià)及最終結(jié)論1概述本品為頭孢類口服固體制劑，細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證選用薄膜過濾法?？刂凭鷻z查方法的驗(yàn)證選用薄膜過濾法，主要

2、為大腸埃希菌檢查法的驗(yàn)證。陽性菌對(duì)照選用相應(yīng)的大腸埃希菌，陰性菌對(duì)照選用金黃色葡萄球菌。2目的確認(rèn)所采用的方法適合于頭孢克肟分散片的微生物限度檢查。即確認(rèn)該供試品在該檢驗(yàn)量和檢驗(yàn)條件下，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性。3范圍適用于本公司生產(chǎn)的頭孢克肟分散片（規(guī)格：0.1g）的微生物限度檢查。4驗(yàn)證程序4.1 培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂養(yǎng)培養(yǎng)基 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 膽鹽乳糖培養(yǎng)基膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 改良馬丁培養(yǎng)基 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基 MUG培養(yǎng)基4.2 驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44 102金黃色葡萄球菌（St

3、aphylococcus aureus）CMCC（B）26 003枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63 501白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F）98 001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98 003以上菌種均由中國藥品生物制品檢定所提供，并且不超過5代。4.3 方法：按中國藥典2005年版二部微生物限度檢查進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。4.3.1菌液制備：4.3.1.1 取經(jīng)3035培養(yǎng)1824小時(shí)的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1ml加0.9%氯化鈉溶液9ml，10倍系列稀釋至10-510-7，細(xì)

4、菌數(shù)約為50100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。4.3.1.2 取經(jīng)2328培養(yǎng)2448小時(shí)的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml加0.9%氯化鈉溶液9ml，10倍系列稀釋至10-510-7，細(xì)菌數(shù)約為50100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。4.3.1.3 取經(jīng)2328培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加入35ml0.9%氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，然后取1ml加0.9%氯化鈉溶液9ml，10倍系列稀釋為10-410-5，細(xì)菌數(shù)約為50100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用（見附表一）。4.3.2 供試品溶液的制備：取供試品10g，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，溶解，制成1：10

5、的溶液，作為供試液。4.3.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證：4.3.3.1 薄膜過濾法：取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，再最后一次沖洗液中加入試驗(yàn)菌50100個(gè)/ml，過濾。取出濾膜，置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，規(guī)定溫度培養(yǎng)2472小時(shí)，觀察計(jì)數(shù)。4.3.3.2 試驗(yàn)組:取供試液1ml，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入50100個(gè)試驗(yàn)菌，作2個(gè)皿/菌株，取出濾膜，置培養(yǎng)基中培養(yǎng)2472小時(shí)觀察計(jì)數(shù)。4.3.3.3 活菌組：測(cè)定每一菌株的試驗(yàn)菌數(shù)，1ml/皿，作2個(gè)皿/菌株。供試品對(duì)照組 ： 測(cè)定供試品本底菌落數(shù)，取供試液1ml，過濾，沖洗，取出濾膜，置培養(yǎng)基中培養(yǎng)2472小時(shí)，觀察計(jì)數(shù)，作2個(gè)皿/菌株。

6、試驗(yàn)結(jié)果(見附表二。結(jié)果判斷4.3.3.6.1驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率?；厥章?%=×100%4.3.3.6.2細(xì)菌計(jì)數(shù)方法與霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法可以不一致。4.3.3.6.3以上各試驗(yàn)菌的回收率均能達(dá)到70%以上的檢測(cè)方法為準(zhǔn)。4.3.3.6.4若試驗(yàn)組的菌種回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70%，按該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。4.3.3.6.5若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試

7、品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。4.3.4.1.1試驗(yàn)組：取供試液10ml，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入10100cfu大腸埃希菌，過濾，取出濾膜，置100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,3537培養(yǎng)1824小時(shí)。取上述培養(yǎng)物0.2ml接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi),培養(yǎng),于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外線下觀察，同時(shí)用未接種MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性，不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MU

8、G陰性，靛基質(zhì)陰 性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性，靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性，靛基質(zhì)陽性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察確認(rèn)是否為大腸埃希菌。若平板上無菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與表1所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落與表1所列的菌落形態(tài)特征相符或凝似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。表1 大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤

9、，常有金屬光澤。麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤陰性菌對(duì)照組：陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，方法同試驗(yàn)組。試驗(yàn)結(jié)果(見附表三。結(jié)果判斷（1）陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。（2）若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查。（3）若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用增加沖洗量、加入中和劑或滅活劑等方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。5再驗(yàn)證如藥品的處方、生產(chǎn)工藝、原輔料制造商、主要制造設(shè)備的變更或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)重新進(jìn)行驗(yàn)證。6結(jié)果的評(píng)價(jià)及最終結(jié)論評(píng)價(jià): 驗(yàn)證結(jié)論批準(zhǔn)：Q A：

10、日期： ：質(zhì) 量 部： 日期： ：驗(yàn)證組組長(zhǎng)： 日期： ： 驗(yàn)證委員會(huì)主任： 日 期： ： 驗(yàn)證委員會(huì)（簽章）年 月 日附表一菌落計(jì)數(shù)（cfu/ml）品名： 批號(hào)： 規(guī)格：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 批號(hào)： 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 批號(hào)：菌種菌落數(shù)(cfu/ml大腸埃希菌(10 金黃色葡萄球菌(10 枯草芽孢桿菌(10 白色念珠菌(10 黑曲霉菌(10 計(jì)數(shù)12平均值檢驗(yàn)人： 日期： 復(fù)核人： 日期：附表二 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證記錄品名： 批號(hào)： 規(guī)格：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 批號(hào)： 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 批號(hào)：菌株大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌菌種代數(shù)試驗(yàn)組菌落數(shù)平均菌落數(shù)菌液組菌落數(shù)平均菌落數(shù)供試品對(duì)照組菌落數(shù)平均菌落數(shù)試驗(yàn)組菌回收率(%結(jié)論：檢驗(yàn)人： 日期： 復(fù)核人： 日期：附表三 大腸埃希菌檢查法驗(yàn)證記錄品名： 批號(hào)： 規(guī)格：膽鹽乳糖培養(yǎng)基 批號(hào)： MUG培養(yǎng)基 批號(hào)：試驗(yàn)菌菌種代數(shù)陰性對(duì)照菌菌種代數(shù)膽鹽乳糖（18-48hr）試驗(yàn)組：+/