miR-221miR-222在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達及臨床意義

1、miR-221/miR-222在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達及臨床意義<                    作者：許踐剛，黃關(guān)立，顏育祥，張憲波，胡曉清，趙挺，張筱驊【摘要】  目的 ：探討miR-221/miR-222在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達及與臨床病理特征的相關(guān)性。方法：應(yīng)用莖環(huán)Real-time RT-PCR方法檢測36例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及癌旁非腫瘤乳腺組織中成簇分布的miR-221

2、和miR-222表達，分析miR-221和miR-222表達與乳腺癌常用的臨床病理指標的關(guān)系。結(jié)果：乳腺癌組織miR-221和miR-222表達明顯高于其對應(yīng)的正常乳腺組織（P值均小于0.05），但miR-221和miR-222兩者比值差異無顯著性（P =0.176）。miR-221和miR-222的表達和雌激素受體狀態(tài)及Her-2表達有關(guān)。低雌激素受體表達和高Her-2表達的乳腺癌組織的miR-221和miR-222表達均明顯高于高雌激素受體和低Her-2表達的標本（P值均小于0.05）。miR-221和miR-222的表達與月經(jīng)狀況、腫塊大小、孕激素受體狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TMN分期無關(guān)。結(jié)

3、論：miR-221/miR-222不但是乳腺癌重要的標記，而且可能成為內(nèi)分泌 治療 抵抗的預(yù)兆性標記物和靶向治療潛在作用靶點。 【關(guān)鍵詞】  miR-221 miR-222 乳腺腫瘤 Abstract:   Objective: To explore the expression of miR-221/miR-222 and its association with clinicopathologic features in invasive ductal carcinoma of the breast cancer. Methods: Expressi

4、ons of miR-221/miR-222 in 36 invasive ductal carcinoma of the breast cancer and their matched non-tumor adjacent tissue specimens were examined by stem-loop real-time RT-PCR method. The relationship between miR-221/miR-222 expression and clinicopathological characteristics were further analyzed usin

5、g nonparametric tests: the Wilcoxon test for comparing 2 paired groups (tumor and paired nontumor)，the Mann-Whitney U-test for 2 independent groups， and the Kruskall-Wallis test for 3 independent groups. Results: Expression of miR-221 and miR-222 in invasive ductal carcinoma of the breast cancer was

6、 obviously higher than that in the matched non-tumor adjacent tissue specimens（P <0.05），but there was no significant difference in the miR-221/miR-222 ratio （P =0.176）. Upregulated miR-221 and miR-222 expression was associated with the status of estrogen receptor and Her-2 expression in breast ca

7、ncer patients. The expression of miR-221 and miR-222 in down-regulation expression of estrogen receptor and up-regulation expression of Her-2 were obviously higher than that in up-regulation expression of estrogen receptor and down-regulation expression of Her-2（P<0.05）. While no significant asso

8、ciation was found between miR-221 and miR-222 expression and menstrual status，the size of tumor， the state of progesterone receptor， lymph node metastasis and TNM clinical stage of breast cancer. Conclusion: The level of miR-22/miR-222 expression not only may be a valuable adjuvant parameter in fore

9、casting breast cancer patients and also be likely to be a predictive endocrine therapy-resistant breast cancer marker thus as a potential therapeutic target. Key words:   miR-221；miR-222；breast neoplasmsicroRNA（miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的長度約22 nt的內(nèi)源性短鏈RNA，它通過和編碼蛋白質(zhì)的mRNA互補結(jié)合，抑制其表達，從而起到調(diào)控細胞的分化、生長、發(fā)育、

10、增殖、代謝、凋亡等功能1-4。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA可作為腫瘤抑制或促進因子參與腫瘤的發(fā)生過程5。miR-221和miR-222是成簇分布的miRNA。研究表明，抑癌基因p276-8，p576、前凋亡因子Bim9，Bmf9等均是mir-222/mir-221的靶基因，參與了肝細胞肝癌6，9、甲狀腺癌8、前列腺癌7等腫瘤的發(fā)生。但迄今為止，關(guān)于mir-222/mir-221與乳腺癌諸多臨床病理特征的關(guān)系鮮有研究。為此，本研究通過莖環(huán)Realt-ime RT-PCR方法檢測了36例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中miR-221和miR-222的表達，分析它們和臨床病理特征的聯(lián)系，探討miR-221和miR-22

11、2在乳腺癌中的作用。1  資料和方法1.1  一般資料 36例女性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標本采自溫州醫(yī)學院附屬定 理學 院和溫州醫(yī)學院附屬第一 醫(yī)院 2008年10月至2009年5月腫瘤外科住院手術(shù)治療的患者，年齡3771歲，中位年齡55歲。乳腺癌組織標本取自病灶中央無壞死部分，另取距腫瘤邊緣約3 cm的癌旁非腫瘤乳腺組織，離體后切成米粒大小，30 min內(nèi)液氮保存。乳腺癌的診斷及常規(guī)病理資料由病理科醫(yī)生盲法閱片后提供。Her-2受體的陽性標準參照FDA推薦的HercepTest結(jié)果評分。雌激素受體和孕激素受體的陽性標準為：腫瘤細胞陽性數(shù)大于10%；小于等于10%則認定

12、為陰性。1.2  RNA抽提 按Trizol試劑（購自Invitrogen公司）說明書抽提樣品總RNA，為增加小RNA得率，異丙醇沉淀步驟改為-20 沉淀2 h以上。 DEPC處理水溶解RNA，分光光度計測定260 nm及280 nm吸光值，確定RNA溶液濃度和純度。取25g總RNA以1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。1.3  miR-221和miR-222表達檢測 以let-7a作為內(nèi)參，分析miR-221和miR-222表達。表1為相關(guān)分析的引物序列（由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成）。1g總RNA分別以miR-221，miR-222及l(fā)et-

13、7a莖環(huán)RT引物進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：16 30 min，42 30 min ，75 15 min，反應(yīng)結(jié)束后-20 保存。以15L反應(yīng)體系進行Real-time定量PCR。miRNA檢測反應(yīng)體系包括：1L RT產(chǎn)物，1×SYBR Green I Mastermix， 0.5mol/L miRNA特異前向引物、0.5mol/L通用的反向引物。Real-time定量PCR條件為：95 10 min后，95 15 s，60 1 min，40循環(huán)。Real-time定量PCR使用Applied Biosystems 7500儀器進行。所有樣品做3復(fù)孔。PCR產(chǎn)物經(jīng)8% PAGE電泳分析。

14、記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達所設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以let-7a作為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對定量法，以N=2-Ct表示腫瘤組織miRNA表達相對于配對的正常組織的變化倍數(shù)，其中Ct=（CtmiRNA-Ctlet-7a）腫瘤-（CtmiRNA-Ctlet-7a）正常。1.4  統(tǒng)計學處理方法 miRNA表達數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。采用非參數(shù)Wilcoxon符號秩和檢驗（配對的正常和腫瘤組），Mann-Whitney U檢驗（兩組）和Kruskal-Wallis H檢驗（多組）進行統(tǒng)計處理。2  結(jié)果2.1  miR-221和

15、miR-222在乳腺癌及對應(yīng)正常乳腺組織中的表達 我們采用Tang等10建立的莖環(huán)RT-PCR分析miR-221和miR-222表達。圖1顯示miR-221，miR-222及l(fā)et-7a keal-time PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線和擴增曲線。以let-7為內(nèi)參，與對應(yīng)正常乳腺組織比較，miR-221和miR-222在乳腺癌中的相對表達量（N=2-Ct）中位數(shù)分別為4.48和3.56，均明顯高于對應(yīng)正常乳腺組織（見圖2）。采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗其差異有顯著性（P值均為0）。乳腺癌miR-221和miR-222表達兩者比較差異無顯著性（P =0.176）（見圖2）。2

16、.2  miR-221和miR-222表達水平與乳腺癌多種臨床病理特征的關(guān)系 由表2可見，miR-221和miR-222的表達在不同雌激素和Her-2表達狀態(tài)存在顯著差異。雌激素受體陰性表達和Her-2陽性表達的乳腺癌組織的miR-221表達明顯高于雌激素受體陽性和Her-2表達陰性的標本（P值分別為0.038和0.025）；miR-222的表達與miR-221類似，雌激素受體陰性表達和Her-2陽性表達的乳腺癌組織表達明顯升高（P值分別為0.017和0.026）。此外miR-221和miR-222的表達在不同增殖指數(shù)（ki67）狀態(tài)也存在一定差異的趨勢（P值分別為0.08

17、9和0.075），在低增殖指數(shù)組（ki6710%）中，其表達低于高增殖指數(shù)組（ki6710%）。miR-221和miR-222的表達與月經(jīng)狀況、腫塊大小、孕激素受體狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TMN分期無關(guān)。3  討論腫瘤的發(fā)生和 發(fā)展 是細胞生長、凋亡等多個相關(guān)基因表達失衡的結(jié)果。跟絕大多數(shù)腫瘤一樣，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展也是一個多基因改變的過程。在分子水平闡明乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制是尋找新的分子治療靶點的基礎(chǔ)。以往的研究大多集中在編碼蛋白的癌基因或抑癌基因上，近年來新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性微小RNA，即miRNA（microRNA），不編碼蛋白質(zhì)，通過堿基配對決定mRNAs的翻譯和穩(wěn)定性，從而調(diào)控細胞的分化、生長、發(fā)育、增殖、代謝、凋亡等功能。miRNA基因分布在除了Y染色體外的人類所有的染色體中10。根據(jù)生物信息學預(yù)測，一種miRNA可調(diào)控多達上百種靶基因的表達，miRNA可以通過其存在、缺失和表達水平的改變影響細胞的生長和分化。