IL1及TNF在關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

1、中國(guó)中醫(yī)急癥年月第卷第期，···實(shí)驗(yàn)研究·IL-1及TNF-在關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究肖金魚(yú)王炳勝王書(shū)杰解放軍第二五一醫(yī)院（河北張家口075000）【摘要】文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1004-745X（2011）04-0607-02目的檢測(cè)白細(xì)胞介素1（IL-1）、腫瘤壞死因子-（TNF-）在佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠模型血清中的水平。方法建立AA大鼠模型，根據(jù)X線片及組織病理學(xué)的特點(diǎn)證實(shí)造模成功。用ELISA法檢測(cè)AA大鼠模型血清中炎性細(xì)胞因子IL-1、TNF-的水平。結(jié)果與對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠血清中IL-1、TNF-水平明顯升高。結(jié)論模型

2、組大鼠血清中含有大量的IL-1、TNF-，提示IL-1、TNF-在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用?！娟P(guān)鍵詞】類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎佐劑性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1腫瘤壞死因子-ExpressionofIL-1andTNF-inAdjuvantArthritisRatsModlesXIAOJin-yu，WANGBing-sheng，WANGShu-jieNo.251HosptalofPLA（Zhangjiakou075000，Hebei）【Abstract】Objective：TodetecttheexpressioncharacteristiceofIL-1andTNF-inadjuvantar

3、thritis（AA）ratsmodel.Methods：AAratsmodelwasestablished，thetheserumlevelofIL-1andTNF-weredeterminedbyELISAandthedegreeofpathogenicityaswellasthepathologicalcharacteristicewereassayedbyhistopathologicaltechniquesandjointroentgenography.Results：Comparedwiththecontrolgroup，theIL-1andtheTNF-wereincreased

4、obviouslyinthemodelgroup.Conclusion：TheserumlevelofIL-1andTNF-mightinvolveinthepathogenesisofrheumatoidarthritis.【Keywords】Rheumatoidarthritis；Adjuvantarthritis；Cellfactor；IL-1；TNF-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的典型病理學(xué)特征為滑膜組織異常增生，其中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)持續(xù)作用于病變部位是導(dǎo)致病變侵蝕進(jìn)展的主要原因之一。細(xì)胞因子通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用引起組織損傷酶的釋放，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷，是RA炎癥和關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)

5、。其中白細(xì)胞介素-1（IL-1）和腫瘤壞死因（TNF-）在RA滑膜炎及軟骨和骨的破壞中起著非常關(guān)鍵的作用1-2。本實(shí)驗(yàn)基于IL-1和TNF-的上述特性，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠模型血清中1.3模型制備30只大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組（10只）、模型組（20只），每組雌雄各半。根據(jù)文獻(xiàn)3方法加以改進(jìn)，正常條件飼養(yǎng)10d后，將弗氏完全佐劑搖勻后，按0.1mL/只將弗氏完全佐劑注于大鼠右后肢足跖內(nèi)造模。造模20d后取5只大鼠（用苦味酸做標(biāo)記），每只大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg待大鼠麻醉后，拍攝大鼠四肢關(guān)節(jié)X線攝片，觀察關(guān)節(jié)破壞情況。30d后取相同大鼠重復(fù)

6、操作，觀察關(guān)節(jié)破環(huán)情況。造模30d后取模型組5只大鼠的踝關(guān)節(jié)，經(jīng)固定、脫鈣石蠟包埋、切片后行蘇木精-伊紅（HE）染色。光鏡下觀察局部組織病理學(xué)變化。IL-1和TNF-，以探討其在動(dòng)物模型中的表達(dá)特點(diǎn)。20只wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（150±30）g，模型評(píng)價(jià)大鼠生長(zhǎng)情況評(píng)價(jià)：造模前稱體質(zhì)量1次，造1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模后每2日測(cè)量1次，記錄動(dòng)物生長(zhǎng)情況。同時(shí)仔細(xì)觀察動(dòng)物的毛色、精神狀態(tài)及關(guān)節(jié)癥狀的變化，模型組動(dòng)物表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕，精神萎靡，帶有病態(tài)，伴輕微脫毛等。對(duì)照組大鼠體質(zhì)量略有增長(zhǎng)，其他方面沒(méi)有明顯明顯變化。大鼠關(guān)節(jié)足腫脹評(píng)價(jià)：注射弗氏完全佐劑后，用容積法排水法測(cè)量雙后肢的

7、足腫脹度。造模前觀察1次，后每周觀察1次，觀察足爪腫脹情況。同時(shí)對(duì)其他合格證號(hào)：0172808，購(gòu)于河北北方學(xué)院動(dòng)物室；飼養(yǎng)條件：SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，全年溫度2124，相對(duì)濕度40%67%，換氣次數(shù)14.417.2次/h，空氣潔凈度600012000級(jí)，梯度壓差19.831.6Pa，噪聲37.245.0dB，菌落數(shù)1.02.1個(gè)/皿，氨濃度3.24.5mg/m3。1.2試藥與儀器TDL80-2B離心機(jī)，EL301stripreader酶標(biāo)儀3只足爪炎癥進(jìn)行評(píng)分。采用4分制的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，每只大鼠的最高分為16分，記錄并比較20d時(shí)，對(duì)照組和造模組關(guān)節(jié)炎指數(shù)和雙后肢足腫脹度平均值差異。購(gòu)于自美國(guó)Bio

8、Tek公司。756MC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。1.5標(biāo)本采集10%的水合氯醛以3.5mL/對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，通信作者開(kāi)胸使心臟暴露，進(jìn)行心臟取血，全血2500r/min離心20min，取·608·中國(guó)中醫(yī)急癥年月第卷第期，血清-20保存?zhèn)溆?。檢測(cè)細(xì)胞因子具體操作按ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。協(xié)調(diào)、促進(jìn)，在多數(shù)情況下表現(xiàn)協(xié)同性生物學(xué)效應(yīng)，是炎癥、組織損傷及免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中占重要地位。IL-1和TNF-可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞、增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，使血液中的白細(xì)胞通過(guò)與黏附分子相互作用被匯集到關(guān)節(jié)腔而誘發(fā)炎癥。IL-1和TNF

9、-可促進(jìn)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成并釋放前列腺素E2和膠原酶，引發(fā)滑膜炎癥反應(yīng)、軟骨基質(zhì)的崩解，而局部免疫復(fù)合物和游離的膠原等分解產(chǎn)物刺激IL-1和TNF-的合成，以致形成一個(gè)惡性循環(huán)。IL-1和TNF-促進(jìn)人軟骨細(xì)胞分泌纖維蛋白溶酶原激活劑，使纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)換成纖維蛋白溶酶而降解纖維蛋白，加速膠原的分解代謝，這些作用均可造成類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的軟骨損傷。IL-1也能抑制膠原及堿性磷酸酶的合成，增加破骨細(xì)胞數(shù)量及骨吸收面積，刺激纖維母細(xì)胞增生，增加破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨的吸收而致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨的破壞4。筆者通過(guò)對(duì)大鼠AA模型的制備及對(duì)照組和模型組大鼠關(guān)節(jié)炎癥積分、影像學(xué)、病理學(xué)等相關(guān)指標(biāo)的評(píng)估，進(jìn)一步探

10、討了統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果模型組大鼠與對(duì)照組大鼠比較，體質(zhì)量明大鼠一般情況顯減輕，模型組關(guān)節(jié)表現(xiàn)為紅、腫、以對(duì)稱性后肢關(guān)節(jié)為主，累及踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、趾間關(guān)節(jié)等。20d左右出現(xiàn)第1個(gè)炎癥高峰后紅腫有一定程度消退；30d達(dá)到第2個(gè)高峰，進(jìn)入慢性期，紅腫逐漸消退逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形以至功能障礙，表明慢性、對(duì)稱性、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生。2.2兩組大鼠雙后肢足腫脹度比較實(shí)驗(yàn)第14日，大鼠關(guān)節(jié)開(kāi)始出現(xiàn)腫脹，而后足首先出現(xiàn)紅腫，后逐漸延伸至前足并日趨嚴(yán)重，20d腫脹達(dá)到最高值后逐漸減輕，模型組與對(duì)

11、照組大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見(jiàn)表1。表1組別對(duì)照組模型組兩組大鼠雙后肢足腫脹度比較（±s)n1010關(guān)節(jié)炎指數(shù)關(guān)節(jié)體積（cm3）IL-1和TNF-在AA模型中的表達(dá)特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-1和TNF-大鼠模型大量增長(zhǎng)與表達(dá)，這與其在RA患者中的相關(guān)表達(dá)特點(diǎn)相類似，說(shuō)明在AA造模過(guò)程中IL-1和TNF-發(fā)揮了重要作用。作為在RA中大量存在的T細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子0.90±0.737.29±1.82*7.15±0.2313.81±1.63*與對(duì)照組比較，*P<005。下同。IL-1和TNF-可能成為評(píng)價(jià)RA病情和治療療效的兩個(gè)

12、最重要免疫學(xué)指標(biāo)?？傊瑢?duì)IL-1和TNF-的深入研究必將有助于對(duì)改變?yōu)橹鳎?0d時(shí)隱約可見(jiàn)骨質(zhì)疏松，關(guān)節(jié)間隙模糊，30d時(shí)可見(jiàn)明確的關(guān)節(jié)間隙模糊、變窄。而對(duì)照組大鼠雙踝關(guān)節(jié)同時(shí)點(diǎn)比較，變化不大，無(wú)明顯骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)間隙清晰、未見(jiàn)骨質(zhì)破壞。RA發(fā)生機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，合理地評(píng)價(jià)RA的病情進(jìn)展，為RA治療，包括藥物及免疫治療提供更加科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。參1考文獻(xiàn)2.4大鼠炎性足爪組織病理學(xué)改變?cè)炷?0d后，模型組大鼠節(jié)腔滑膜層次增多可達(dá)68層，甚至十余層且排列不規(guī)整，滑膜內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，且在關(guān)節(jié)軟骨附近有血管翳形成，引起關(guān)節(jié)軟骨和骨組織破壞。StrandV，Kavana

13、ughAF.Theroleofinterleukin-1inboneresorp-tioninrheumatoidarthritisJ.Rheumatology，2004，43（Suppl3）：220-226.2ZwerinaJ，HayerS，Tohidast-AkradM，etal.Singleandcombinedin-hibitionoftumornecrosisfactor，interleukin-1，andRANKLpathwaysintumornecrosisfactor-inducedarthritis：effectsonsynovialinflam-mation，boneero

14、sion，andcartilagedestructionJ.ArthritisRheum，2004，50（1）：277-290.較對(duì)照組均明顯升高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。見(jiàn)表2。表2兩組大鼠炎性細(xì)胞因子水平比較（ng/L，±s)組別對(duì)照組模型組3n1010IL-1109.40±9.81228.46±29.62*TNF-148.43±15.19220.68±20.62*DelwigA，AltmannDM，IsaacsJD，etal.TheimpactofglycosylationonHLA-DR1-restrictedTcell

15、recognitionoftypeIIcollageninamousemodelJ.ArthritisRheum，2007，54：482-491.4YinT.InvolvementofIL-6signaltransducergp130inIL-11-mediat-edsignaltransductionJ.JImmunol，1993，15（3）：2555-2561.3討論IL-1和TNF-主要由單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌，二者相互（收稿日期2010-11-21）(上接第565頁(yè))陰增液，通利膈咽。方用麥門(mén)冬湯合益胃湯加減。藥用沙參、麥冬、法半夏、白芍、陳皮、甘草、蒲公英、木蝴蝶、麥芽。若陰傷較重，病史較久，則用一貫煎加味；若大便干結(jié)難解，則加瓜蔞仁、火麻仁；夜寐不安加酸棗仁、夜交藤；疼痛較著，則加金鈴子散、失笑散；呃逆嘔吐，則合橘皮竹茹湯。噯