Atfad8葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草對冷脅迫的生理響應(yīng)

1、Atfad8葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草對冷脅迫的生理響應(yīng)煙草是我國主要經(jīng)濟作物之一，分布區(qū)域廣，不同產(chǎn)區(qū)煙葉質(zhì)量不同。低溫侵襲一直制約著優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的發(fā)展，如何提高煙草抗低溫的能力受到了越來越多的關(guān)注。利用基因工程技術(shù)將外源抗逆基因?qū)霟煵莼蚪M，是培育抗性品種的最有效的方法之一。fad8 是擬南芥中的冷誘導基因，在低于20條件下誘導表達增加三烯酸含量，維持低溫下葉綠體膜的流動性及完整性1。三烯脂肪酸水平的提高對植物耐寒性具有非常重要的作用2，植物葉片組織中三烯脂肪酸的形成主要由葉綠體中的fad7 基因負責。Gibson 等3將分離的fad8 cDNA 轉(zhuǎn)化到fad7 突變體中正常表達，并表現(xiàn)出遺傳互補

2、現(xiàn)象，表明fad7 和fad8的基因產(chǎn)物具有相同的功能。Wang4等克隆了水稻的fad8 cDNA，將其在CaMV 35S 啟動子下正向表達，提高了植物對低溫的抗性。與其它的植物去飽和酶基因相比，一般的生長條件下fad8 基因的mRNA 表達水平比較穩(wěn)定，而在低溫條件下其表達水平立即明顯升高。證實fad8 的作用是當植物處于較低生長溫度條件下時，產(chǎn)生更多的-3 脂肪酸去飽和酶。本研究以轉(zhuǎn)Atfad8 的葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草為材料，在5低溫脅迫條件下，對煙草幼苗抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量變化進行測定，檢測轉(zhuǎn)Atfad8 的葉綠體基因煙草對冷脅迫的抗性，為弄清膜脂在植物感應(yīng)低溫中的

3、作用以及植物的低溫抗性機理奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料的培養(yǎng)轉(zhuǎn) Atfad8 的葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草（G1-1）和野生型（WT）煙草種子經(jīng)精選后，70%酒精消毒3 分鐘， 10%的次氯酸鈉消毒10 分鐘，滅菌水沖洗56 次，轉(zhuǎn)入MS 滅菌培養(yǎng)基的平皿，轉(zhuǎn)基因煙草培養(yǎng)平皿中含壯觀霉素, WT 培養(yǎng)平皿中不含壯觀霉素。平皿封口后于25，光照16 小時/天培養(yǎng)， 2 周后將萌發(fā)小苗移栽至無菌培養(yǎng)瓶，小苗生長到4 周時進行低溫處理。1.2 材料的處理將培養(yǎng)的轉(zhuǎn)fad8 基因煙草和野生型煙草放入5培養(yǎng)箱。低溫脅迫處理的時間為0、3、6、12、18 天。每處理35 次重復，取相同部位葉片用于實驗測定。

4、1.3 實驗方法葉片生理生化指標測定：丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定5，CAT 活性、 SOD活性、 POD 活性測定參照Shah 等6的方法。2 結(jié)果與分析2.1 冷脅迫下煙草超氧化物岐化酶（SOD）的變化SOD是細胞內(nèi)的重要保護酶，在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)fad8基因及對照植株SOD活性均提高。在非脅迫條件下，轉(zhuǎn)fad8基因煙草與野生型煙草SOD的活性幾乎無差異，在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草SOD活性先升高，脅迫6天時都達到最大值。此時野生型煙草SOD活性是非脅迫下的2.1倍；轉(zhuǎn)基因煙草是非脅迫下的2.4倍。隨后二者活性下降，但轉(zhuǎn)fad8基因煙草SOD活性下降緩慢，低溫處理18

5、天時仍然保持較高水平，是非脅迫下的1.86倍；而野生型煙草SOD活性大幅下降，是非脅迫下的1.5倍。2.2 冷脅迫下煙草過氧化物酶（POD）的變化過氧化物酶（POD）是防止膜脂過氧化的重要酶類，5低溫處理過程中，轉(zhuǎn)fad8基因及野生型煙草植株P(guān)OD活性均隨著處理時間的延長而增強。未經(jīng)低溫處理的轉(zhuǎn)fad8基因煙草與野生型煙草POD活性相近，沒有明顯差異；隨著低溫處理時間的延長，轉(zhuǎn)fad8基因煙草和野生型煙草POD活性都呈上升趨勢，但轉(zhuǎn)基因煙草上升幅度高于野生型煙草。5處理6天時，轉(zhuǎn)fad8基因煙草POD活性是非脅迫下的2.4倍，而野生型煙草POD活性是非脅迫下的2.1倍。低溫處理18天時，野生型

6、煙草POD活性是非脅迫下的3.2倍，而轉(zhuǎn)fad8基因煙草的活性是非脅迫下的5.5倍，轉(zhuǎn)fad8基因煙草葉片中POD活性明顯高于野生型煙草。2.3 冷脅迫下煙草過氧化氫酶（CAT）的變化過氧化氫酶(CAT)是植物體內(nèi)重要的活性氧清除劑，其生理作用是將H2O2還原為H2O和O2。CAT活性升高意味著活性氧對植物細胞傷害程度的減弱。在非脅迫條件下，轉(zhuǎn)fad8基因煙草與野生型煙草CAT的活性幾乎無差異，在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)fad8基因煙草和野生型煙草CAT活性先升高，在低溫脅迫6天時兩者都達到最大值，野生型煙草CAT活性是非脅迫下的1.7倍；轉(zhuǎn)fad8基因煙草是非脅迫下的2.0倍。隨后兩者活性下降，但轉(zhuǎn)f

7、ad8基因煙草下降緩慢，低溫處理18天時，仍高于非脅迫下的活性，而野生型煙草CAT活性下降至脅迫前水平。2.4 冷脅迫下煙草丙二醛（MDA）的變化丙二醛是細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的高低反映了細胞膜脂過氧化水平。在未經(jīng)低溫處理時，轉(zhuǎn)fad8 基因及對照植株MDA 均在36 nmol/g 左右。隨著低溫處理時間的延長，轉(zhuǎn)fad8 基因煙草和野生型煙草MDA 的含量都呈上升趨勢，但野生型煙草上升幅度明顯高于轉(zhuǎn)基因煙草。5處理6 天時，野生型煙草葉片MDA 含量是非脅迫下的1.6 倍，轉(zhuǎn)fad8基因煙草葉片MDA 含量是非脅迫下的1.1 倍，處理18 天時野生型煙草葉片MDA 含量是非脅迫下的2.

8、2 倍，而fad8 轉(zhuǎn)基因煙草葉片MDA 含量是非脅迫下的1.6 倍，轉(zhuǎn)基因煙草葉片中MDA 含量明顯低于野生型煙草。3 討論在植物體內(nèi)，大部分逆境脅迫最先引起的反應(yīng)是過氧化脅迫反應(yīng)7。低溫脅迫下，植物體內(nèi)的SOD、POD、CAT 等抗氧化酶活性增加，從而清除脅迫產(chǎn)生的過氧化基團，調(diào)節(jié)植物在脅迫下的生理反應(yīng)，是植物對逆境脅迫的適應(yīng)機制8-12，抗氧化酶活性與低溫脅迫下植物的抗逆性密切相關(guān)。SOD 酶活性是機體中清除超氧自由基最有效的酶，其能以超氧自由基O2-為基質(zhì)進行歧化反應(yīng)，避免了自由基對機體尤其是細胞膜的攻擊和傷害，SOD 活性的高低是機體抗逆境能力的標志13。本實驗中，低溫脅迫條件下的兩

9、種煙草的SOD 活性均高于非脅迫條件，在脅迫處理6 天時達到最高，在脅迫條件下轉(zhuǎn)fad8 基因的煙草SOD 的活性大大高于野生型煙草，野生型煙草在處理6 天、12 天、18 天中SOD 的活性下降趨勢較轉(zhuǎn)fad8 基因的煙草更為明顯。說明轉(zhuǎn)fad8 基因煙草在低溫脅迫下SOD 活性提高，而且可以在植物體內(nèi)維持一定的水平。SOD 可以清除植物體內(nèi)的活性氧，從而緩解低溫脅迫對植物的傷害。SOD 在清除自由基同時生成過氧化氫（H2O2），H2O2 可以被POD 及CAT 分解。POD 和CAT 是植物體內(nèi)重要的保護酶。本實驗中低溫脅迫條件下，隨SOD 活性的變化，CAT 和POD 活性也發(fā)生相應(yīng)的變

10、化，兩種煙草的POD 活性在低溫脅迫下一直升高，轉(zhuǎn)Atfad8 基因煙草植株的POD 活性提高的程度大于野生型的煙草。兩種煙草的CAT 活性在低溫脅迫下出現(xiàn)先升高后下降的一致變化。處理6 天時，植株CAT 酶活性最高，轉(zhuǎn)Atfad8 基因煙草植株的CAT 活性均高于野生型的煙草。POD 活性的提高能更有效地清除過氧化氫。由于抗寒性強的植物在逆境中POD 活性明顯高于抗寒性差的植物， POD 活性變化可作為鑒定植物抗寒性的生理指標14，本實驗中轉(zhuǎn)Atfad8 基因煙草植株的POD 活性提高，說明轉(zhuǎn)Atfad8 基因煙草植株的低溫耐性明顯高于野生型的煙草，CAT 活性提高說明活性氧對植物細胞傷害程

11、度減弱。由于低溫脅迫，細胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞從而導致活性氧的產(chǎn)生，活性氧的毒害會引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，造成細胞系統(tǒng)的損傷。作為膜脂過氧化產(chǎn)物，MDA 含量的變化是質(zhì)膜損傷程度的重要標志之一，也是衡量植物在低溫脅迫下膜結(jié)構(gòu)完整性的較好指標15。煙草在5低溫脅迫下，MDA 含量逐漸提高，6 天時增加較快。在整個處理過程中，野生型煙草的MDA 含量都高于轉(zhuǎn)基因植株MDA 含量。說明低溫下，野生型的煙草膜脂過氧化作用較嚴重，而轉(zhuǎn)Atfad8 基因的煙草植株葉片膜受害程度較輕，植株抗寒冷性增強。已有研究結(jié)果表明，fad8 在擬南芥、水稻等植物中過量表達提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗低溫脅迫能力1,4。本

12、實驗對轉(zhuǎn)Atfad8 基因的煙草保護酶系統(tǒng)進行測定，轉(zhuǎn)Atfad8 基因植株SOD、POD、CAT 和MDA 活性均表現(xiàn)出對低溫脅迫的響應(yīng)，同野生型煙草相比，轉(zhuǎn)Atfad8 基因的煙草抗氧化酶活性明顯提高，丙二醛含量顯著降低，說明fad8 基因在植物體內(nèi)表達可以提高植物對低溫脅迫的防御能力，此種生理響應(yīng)很可能與低溫下fad8 產(chǎn)物的-3 脂肪酸去飽和酶水平的提高，維持葉綠體膜的流動性及完整性有關(guān)。在低溫抗性分子育種中可以通過相關(guān)途徑提高農(nóng)林作物的抗冷害能力。參考文獻1 沈奇.轉(zhuǎn)擬南芥fad8 基因油菜脂肪酸代謝及抗寒性的研究D.貴陽市:貴州大學,2007.2 Kodama H,Hamada T

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