AT2對成年壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞TNFα、IL1β及IL6分泌的調(diào)控

1、AT2對成年壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞TNF、IL1及IL6分泌的調(diào)控    論文既是探討問題進(jìn)行科學(xué)研究的一種手段，又是描述科研成果進(jìn)行學(xué)術(shù)交流的一種工具.    Call no man happy until he dies.                作者：周娟，徐心，劉進(jìn)軍，林元喜，高廣道【摘要】  目的 觀察AT2對肥大心肌細(xì)胞炎癥因子合成的調(diào)控

2、作用及AT1和AT2間的相互關(guān)系。方法 采用腹主動(dòng)脈縮窄法構(gòu)建SD大鼠壓力超負(fù)荷性心肌肥大模型。選用術(shù)后8周肥大的心肌細(xì)胞，將其分為Ang組、Ang+losartan組、Ang+PD123319及Ang+losartan+PD123319組。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束，RTPCR法檢測細(xì)胞TNF、IL1及IL6的mRNA表達(dá)水平，放免法檢測TNF、IL1及IL6的蛋白表達(dá)()。結(jié)果 與Ang組相比，AT1拮抗劑losartan不影響TNF和IL1的mRNA及蛋白表達(dá)。單獨(dú)應(yīng)用AT2拮抗劑PD123319及聯(lián)合應(yīng)用losartan和PD123319均可使TNF和IL1的mRNA及蛋白表達(dá)水平

3、下調(diào)。聯(lián)合應(yīng)用二者TNF和IL1 mRNA的表達(dá)水平介于單獨(dú)應(yīng)用losartan和PD123319組之間。與Ang單獨(dú)聯(lián)用losartan或PD123319相比，同時(shí)聯(lián)用二者可使IL6 mRNA的表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論 AT2參與了肥大心肌細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)調(diào)控。AT1與AT2之間并非簡單的拮抗關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】  心肌細(xì)胞；血管緊張素二型受體；腫瘤壞死因子；白介素1；白介素6The love of money is the root of all evil.  ABSTRACT: Objective 

4、60;To investigate the role of AT2 in inflammatory factor synthesis of adult hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure overload and the relationship between AT1 and AT2. 

5、Methods  The left ventricular hypertrophy induced by pressure overload was achieved by placing a band around the abdominal aorta. We isolated and purified hypertrophic cardiom

6、yocytes at 8 weeks after operation. The cardiomyocytes were randomly divided into 4 groups: Ang, Ang+losartan, Ang+PD123319 and Ang+losartan+PD123319 groups. The mRNA levels of TNF

7、, IL1 and IL6 were detected by RTPCR and the protein expression of TNF, IL1 and IL6 in medium were detected by radioimmunoassay. Results  Compared with that of&

8、#160;the Anggroup, losartan could not influence the mRNA and protein expression of TNF and IL1, but PD123319 decreased them severely. The mRNA and protein expression of T

9、NF and IL1 also decreased with losartan and PD123319 treatment, but they were higher than in PD123319 alone treatment group. Compared with the Ang, Ang+losartan and Ang+P

10、D123319 groups, the IL6 mRNA increased when cells were treated with losartan and PD123319 simultaneously. Conclusion  AT2 can regulate the expression of inflammatory factors o

11、f hypertrophic cardiomyocytes. The relationship between AT1 and AT2 is not only antagonistic.Nature is the glass reflecting truth.  KEY WORDS: cardiomyocyte; angiotensinreceptor 2 (AT2); TNF; IL1;

12、0;IL6作為心血管系統(tǒng)關(guān)鍵性調(diào)控因子的血管緊張素(angiotensin, Ang)在心肌中主要有型受體(AT1)和型受體(AT2)(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。已證實(shí)，AT1可介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞的增殖以及膠原的合成，從而誘發(fā)心肌重構(gòu)，而AT2的功能至今尚不完全清楚。大多學(xué)者認(rèn)為AT2可以拮抗AT1的效應(yīng)，但近來也有研究結(jié)果與此相異12。    研究提示，在多種心臟疾病中表達(dá)增多的炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白介素1(interleukin1,&#

13、160;IL1)及白介素6(interleukin6, IL6)3等在疾病的發(fā)生發(fā)展中均具有廣泛的病理生理作用。TNF、IL1及IL64均可以引起明顯的細(xì)胞肥大效應(yīng)：暴露于IL1和IL6的心肌細(xì)胞不僅蛋白質(zhì)合成增加，一些胎兒期基因，如心房利鈉多肽(atrial natriuretic peptide, ANP)及肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)的表達(dá)也明顯增加56；心臟過表達(dá)TNF的轉(zhuǎn)基因小鼠不僅存在心肌細(xì)胞的肥大和功能異常，其心力衰竭和死亡的發(fā)生率也明顯增加7。此外，IL6及TNF等還具有明顯

14、的負(fù)性肌力作用，從而抑制心臟的收縮功能；慢性心力衰竭患者體內(nèi)IL1和TNF含量的升高與室壁應(yīng)力增加間的相互作用，共同參與了疾病的發(fā)生8。   Ang及其兩型受體在肥大的心肌細(xì)胞中的相互作用以及其對細(xì)胞因子表達(dá)及釋放的影響目前還較少涉及。因此，本實(shí)驗(yàn)以壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞為研究對象，探討AT1和AT2對肥大心肌細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控作用，同時(shí)觀察AT1與AT2之間的相互關(guān)系。Answer a fool according to his folly.  1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  

15、雄性SD大鼠，體重220-250g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。  1.2  藥品及試劑  Ang、PD123319、洛沙坦(losartan)、型膠原酶(collagenase)、型膠原酶(collagenase)及牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)為Sigma公司產(chǎn)品；M199培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品；Trizol 及Taq酶為Promega公司產(chǎn)品；dNTPs及100bp DNA Ladder為華美生物工程公司產(chǎn)品；引物由上海康成生物技

16、術(shù)有限公司合成；放免試劑盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所。  1.3  壓力超負(fù)荷性心肌肥大模型的構(gòu)建  將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2組：腹主動(dòng)脈縮窄(aortaconstriction, AC)組，于左腎動(dòng)脈上方小心分離長約3mm的腹主動(dòng)脈，套以內(nèi)徑為0.8mm的銀夾造成縮窄；假手術(shù)(shamoperation, SO)組，除不以銀夾縮窄腹主動(dòng)脈外，其余操作同AC組。手術(shù)后飼養(yǎng)8周處死取材。1.4  心肌肥大指數(shù)測定  測取左心室濕重(包括左心室游離壁和室間隔)，計(jì)算左心室重與體重比值(

17、left ventricle/body weight ratio, LV/Bwt)作為心肌肥大指標(biāo)。作HE染色切片，使用目鏡測微尺測量心肌細(xì)胞橫徑(left ventricular cardiomyocytes transection diameter, LVTDM)。高倍鏡下(10×40)隨機(jī)選取20個(gè)橫紋清晰、胞核完整、形狀規(guī)則的心肌細(xì)胞，測其橫徑，取其均值作為心肌肥大另一指標(biāo)。Wine and judgement mature with age.  1.5  

18、心肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng)  采用膠原酶Langendorff灌流法獲取所需手術(shù)組肥大心肌細(xì)胞。并將分離所得心肌細(xì)胞置于含有2g/L BSA、5mmol/L肌酸、5mmol/L牛璜酸、2mmol/L肉毒堿、100u/mL胰島素、100u/mL青霉素以及100g/mL鏈霉素的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞隨機(jī)分為：Ang組(終濃度10-6mol/L)；Ang+AT1受體拮抗劑losartan組(用終濃度10-5mol/L的losartan預(yù)處理1h后加入Ang)；Ang+AT2受體拮抗劑PD123319組(用終濃度10-5mol/L的PD123319預(yù)處理1h后加入Ang)；

19、Ang+losartan+PD123319組(用losartan和PD123319同時(shí)預(yù)處理1h后加入Ang)。處理因素作用24h后，RTPCR檢測細(xì)胞TNF、IL1及IL6的mRNA水平；另培養(yǎng)的肥大心肌細(xì)胞同樣分組干預(yù)36h后收集培養(yǎng)液上清，放免法檢測其中TNF、IL1及IL6的蛋白表達(dá)水平。1.6  RTPCR  一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增。條件為：94變性1min，退火1min，72延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，于72再延伸5min。引物序列、產(chǎn)物長度及退火溫度見表1。以actin作為內(nèi)參照，用三者凝膠成像后的灰度值與ac

20、tin相比，代表三者的相對表達(dá)水平。1.7  放射免疫檢測分析  按放免試劑盒操作步驟進(jìn)行。Wine and judgement mature with age.  1.8  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  數(shù)據(jù)以±s表示，SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，各組間相互比較分析采用單因素方差分析(oneway ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié)果2.1  模型構(gòu)建及結(jié)果  縮窄大鼠腹主動(dòng)脈8周后，左心室重/體重比值明顯增大，

21、HE染色切片顯示模型組左室心肌細(xì)胞橫徑增加，提示心肌細(xì)胞明顯肥大(表2)。表1  RTPCR引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長度（略）Table 1  Sequence, expected fragment size and annealing temperature of each PCR primer and product表2  左心室重/體重比和心肌細(xì)胞橫徑（略）Table 2 

22、0;The LV/Bwt and LVTDM(n=8)*P<0.05 vs. SO group. SO: shamoperation; AC: aortaconstriction; LVTDM: left ventricular cardiomyocytes transection diameter; LV/Bwt: left ventricle/ body weight 

23、;ratio2.2  AT1和AT2對壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞TNF、IL1及IL6表達(dá)的調(diào)控  在mRNA水平上與Ang組相比，AT1拮抗劑losartan不影響Ang誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞TNF和IL1的表達(dá)，而AT2拮抗劑PD123319可顯著下調(diào)二者的表達(dá)。同時(shí)應(yīng)用losartan和PD123319也可使Ang誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞TNF和IL1的表達(dá)下調(diào)，但其水平介于單獨(dú)應(yīng)用losartan和單獨(dú)應(yīng)用PD123319之間。與Ang組相比，單獨(dú)聯(lián)用losartan或PD123319均不影響肥大心肌細(xì)胞IL6的表達(dá)。但較Ang組、單獨(dú)應(yīng)用losartan或

24、PD123319組，同時(shí)應(yīng)用二者卻可使IL6的mRNA表達(dá)水平顯著升高(表3、圖1-3)。表3  肥大心肌細(xì)胞中TNF、IL1及IL6 mRNA的表達(dá)（略）Table 3  The mRNA expression of TNF, IL1 and IL6 of hypertrophic cardiomyocytes*P<0.05 vs. Anggroup; #P<0.05 vs.

25、0;Ang+losartan group; P<0.05 vs. Ang+PD123319圖1  壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞中TNF mRNA的表達(dá)（略）Fig.1 Expression of TNF mRNA in hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure overloadM: marker; A: Ang; B:An

26、g+losartan;C: Ang+PD123319; D: Ang+losartan+PD123319圖2  壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞中IL1 mRNA的表達(dá)（略）Riches do not always bring happiness.  Fig.2 Expression of IL1 mRNA in hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure overload

27、  M: marker; A: Ang; B:Ang+losartan;C: Ang+PD123319; D: Ang+losartan+PD123319圖3  壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞中IL6 mRNA的表達(dá)（略）Fig.3 Expression of IL6 mRNA in hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure ov

28、erloadM: marker; A: Ang; B:Ang+losartan;C: Ang+PD123319; D: Ang+losartan+PD123319   在蛋白質(zhì)水平上，與Ang組相比，losartan不影響肥大心肌細(xì)胞TNF和IL1的表達(dá)，單獨(dú)聯(lián)用PD123319或與losartan合用均可使TNF和IL1的表達(dá)下調(diào)。聯(lián)合聯(lián)用二者與單獨(dú)聯(lián)用losartan組相比，IL1的表達(dá)也有所下調(diào)。    因培養(yǎng)液上清中IL6的含量過低，實(shí)驗(yàn)中采用的方

29、法未能檢出。因此，以上mRNA水平上IL6的相關(guān)結(jié)果，在蛋白水平上未觀察到(表4)。 論文教育信息網(wǎng)  If you run after two heares, you will ca.  表4  放免法測定肥大心肌細(xì)胞中TNF、IL1及IL6的蛋白表達(dá)（略）The farmers are the founders of civilization and prosperity.  Table 4  The protein expression of TNF,

30、0;IL1 and IL6 of hypertrophic cardiomyocytes*P<0.05 vs. Anggroup; #P<0.05 vs. Ang+losartan group3  討論    經(jīng)腹主動(dòng)脈縮窄8周，SD大鼠左心室重/體重比值明顯增大，左室心肌細(xì)胞橫徑增加約45%，表明我們獲得的確為肥大心肌細(xì)胞。有資料表明，Ang可以促進(jìn)正常心肌細(xì)胞合成TNF，且用losartan預(yù)處理可明顯減少培養(yǎng)

31、液中的TNF含量9，說明此過程由AT1介導(dǎo)。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阻斷AT1并不能顯著影響壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞TNF的表達(dá)，而AT2拮抗劑PD123319卻可以顯著下調(diào)TNF mRNA及蛋白表達(dá)水平。同時(shí)，也對在心肌重塑中同樣起重要作用的IL1和IL6進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明：在壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞中對IL1起主要調(diào)控作用的仍為AT2，阻斷AT2可使其表達(dá)明顯下調(diào)。因細(xì)胞培養(yǎng)上清液中濃度過低，我們未能檢測出各組培養(yǎng)液中IL6的蛋白表達(dá)水平。而有關(guān)AT2受體通過激活NFB通路參與組織和器官炎癥過程的現(xiàn)象，在腎臟和血管平滑肌細(xì)胞中也已經(jīng)得到了證實(shí)。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能由于：其他學(xué)者的研究對象

32、多為新生大鼠心肌細(xì)胞，而已知新生大鼠與成年大鼠心肌細(xì)胞表型的特性存在著明顯的差異，建立在新生大鼠心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能完全等同于成年大鼠心肌細(xì)胞；正常與壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞表面AT1與AT2受體的表達(dá)量明顯不同，而且壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞本身已存在明顯的形態(tài)和基因改變，因而建立在正常大鼠心肌細(xì)胞上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不能完全等同于已經(jīng)發(fā)生肥大的心肌細(xì)胞。    目前大多研究者認(rèn)為AT2可以對抗AT1介導(dǎo)的心肌細(xì)胞生長效應(yīng)1011，且阻斷AT1抑制細(xì)胞肥大過程至少有部分是通過同時(shí)活化的AT2介導(dǎo)的12。然而，也有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二者之間也可能存在著協(xié)同關(guān)系：Ry

33、ckwaert等采用成年雄性Wistar大鼠研究心臟AT2與AT1在缺血再灌注中的作用。結(jié)果表明AT2與AT1的作用具有累積效應(yīng)，因?yàn)橥瑫r(shí)阻斷兩種受體比單純阻斷任何一種受體都更能促進(jìn)心功能的恢復(fù)1；另一研究小組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)：聯(lián)合應(yīng)用losartan 和PD123319較之單獨(dú)應(yīng)用任一拮抗劑都更能降低胰島素引起的低血糖大鼠血漿中腎上腺素的濃度2。    而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果則提示AT2與AT1之間的關(guān)系較為復(fù)雜。在mRNA水平上，與Ang組相比，單獨(dú)聯(lián)用PD123319雖可明顯下調(diào)TNF及IL1的表達(dá)，但同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用losartan 和PD

34、123319卻使下調(diào)的mRNA有所上升，提示在對壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞TNF及IL1mRNA的表達(dá)調(diào)控中AT1與AT2之間可能存在拮抗關(guān)系。同樣，在mRNA水平上，與Ang組相比，單獨(dú)聯(lián)用losartan或PD123319均不能顯著影響IL6的表達(dá)，但同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用losartan和PD123319卻可使其表達(dá)水平升高，提示在對壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞IL6 mRNA的表達(dá)調(diào)控上AT1與AT2之間可能存在著協(xié)同關(guān)系。由于蛋白質(zhì)的表達(dá)還存在轉(zhuǎn)錄后翻譯等多個(gè)環(huán)節(jié)，因而其差異不如mRNA水平上的結(jié)果顯著。因此，相比之下mRNA水平上的結(jié)果可以更為清楚的闡明壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞中AT2與

35、AT1之間的相互關(guān)系。而有關(guān)AT2在心肌重塑中的作用還有待于進(jìn)一步的深入研究。    總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AT2參與了壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞中細(xì)胞因子TNF、IL1及IL6表達(dá)的調(diào)控。AT2與AT1之間的關(guān)系較為復(fù)雜，二者之間并不是簡單的拮抗關(guān)系。【參考文獻(xiàn)】  1Ryckwaert F, Colson P, Guillon G, et al. Cumulative effects of AT1 and 

36、;AT2 receptor blockade on ischaemiareperfusion recovery in rat hearts J. Pharmacol Res, 2005, 51(6):497502.2Worck RH, Frandsen E, Ibsen H, et al. AT1 and AT2 receptor blockade

37、 and epinephrine release during insulininduced hypoglycemia J. Hypertension, 1998, 31(1 Pt 2):384390.3程翔，廖玉華，李彬, 等. 早期美托洛爾治療對急性心肌梗死大鼠心肌炎癥因子表達(dá)和心功能的影響 J. 中華心血管病雜志, 2005, 33(5):448452.4Tanaka T, Kanda

38、60;T, Takahashi T, et al. Interleukin6induced reciprocal expression of SERCA and natriuretic peptides mRNA in cultured rat ventricular myocytes J. J Int Med Res, 2004, 32(1):5

39、761.5Ng DC, Long CS, Bogoyevitch MA. A role for the extracellular signalregulated kinase and p38 mitogenactivated protein kinases in interleukin1 betastimulated delayed signal tranducer

40、 and activator of transcription 3 activation, atrial natriuretic factor expression, and cardiac myocyte morphology J. J Biol Chem, 2001, 276(31):2949029498.6Tanaka T, Kanda T, Itoh

41、 T, et al. Increased cardiac weight in interleukin6 transgenic mice with viral infection accompanies impaired expression of natriuretic peptide genes J. Res Commun Mol Pathol Pharmacol, 2001, 110(56):275283. 7Janczewski AM, Kadokami T, Lemster B, et al. Morphological and functional changes in cardiac myocytes isolated from mice overexpressing TNFalp