FLT3靶向短發(fā)夾狀干擾RNA體外轉(zhuǎn)錄合成及作用

1、    FLT3靶向短發(fā)夾狀干擾RNA體外轉(zhuǎn)錄合成及作用    作者：盧潔，盛光耀，鄒湘，方營旗，趙曉明，徐學(xué)聚，白松婷，許培榮，王建人【摘要】  FMS樣酪氨酸激酶3(FLT3)是一種酪氨酸激酶受體，在大多數(shù)急性髓系白血病(AML)患者中持續(xù)激活，與患者預(yù)后差密切相關(guān)。為探討3種FLT3靶向短發(fā)夾狀干擾RNA(shRNA)對急性髓系白血病細(xì)胞株THP1的沉默效應(yīng)，設(shè)計和體外轉(zhuǎn)錄合成3個FLT3靶向shRNA (shRNA1、shRNA2、shRNA3),體外轉(zhuǎn)染THP1細(xì)胞;以RTPCR法檢測FLT3 mRNA水

2、平表達(dá)，用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光測定法檢測FLT3蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：shRNA1、shRNA3可顯著下調(diào)FLT3 mRNA的表達(dá)，其中shRNA1的抑制作用較強(qiáng)。25 nmol/L shRNA1轉(zhuǎn)染48小時對FLT3 mRNA的抑制率是(72.95±2.07)%，作用可達(dá)72小時。5 nmol/L及以上濃度的shRNA1對FLT3 mRNA表達(dá)有下調(diào)作用，作用存在量效關(guān)系。15 nmol/L shRNA1的抑制率是(67.53±0.66)%。FLT3蛋白位于細(xì)胞膜上，shRNA1對其有較強(qiáng)的抑制作用，轉(zhuǎn)染72小時蛋白抑制率達(dá)(79.67±0.66)%。結(jié)論：FL

3、T3shRNA1具有較好的FLT3基因靶向抑制作用，可作為進(jìn)一步研究該基因作用機(jī)制及靶向治療可能性的工具。 【關(guān)鍵詞】  急性髓系白血病    In Vitro Transcription Synthesis and Effects of FLT3 Targeted Short Hairpin RNA      Abstract    FMSlike tyrosine kinase 3 (FLT3) is a receptor of tyrosine kinase that

4、is constitutively activated in most of acute myeloid  leukemia patients and seems to give an adverse prognosis. In order to explore the silencing effect of FLT3 targeted short hairpin RNA (FLT3shRNA) on acute leukaemia cell line THP1, three FLT3shRNAs (shRNA1, shRNA2, shRNA3) were designed and

5、synthesized by transcription system  in vitro and then transfected into THP1 cells. FLT3 mRNA was analyzed by semiquantitative RTPCR, FLT3 protein was detected by Flow cytometry and immunofluorescence. The results indicated that FLT3 expression was downregulated by shRNA1 and shRNA3, and shRNA1

6、 showed stronger inhibitory effect. At 48 hours following transfection, the inhibitory rate of 25 nmol/L shRNA1 was 72.95±2.07%, lasting 72 hours. The 5 nmol/L and more concentration of  FLT3 shRNA1 could downregulate FLT3 mRNA level, which displayed a quantityeffect relation; the inhibito

7、ry rate of 15 nmol/L shRNA1 was 67.53±0.66%. FLT3 protein was located on THP1 cell membrance, its expression was downregulated obviously by shRNA1，at 72 hours following transfection the inhibitory rate of shRNA1 was 79.67±0.66%. shRNA1 showed the best inhibitory effect on FLT3 protein,

8、0; the optimal time of which was 72 hours with an inhibitory rate of 79.67%.  It is concluded that FLT3shRNA1 shows a desireable FLT3targeted inhibitory effect, which can be used for further investigation of FLT3 mechanism or FLT3 targeting treatment.    Key words  

9、0; acute myeloid leukaemia；FLT3；FLT3shRNA; RNA interfering；THP1 cell line     FMS樣酪氨酸激酶3(FMSlike tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3)是型受體酪氨酸激酶(RTK)受體家族的成員，與急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)關(guān)系密切1,2。大多數(shù)AML細(xì)胞表面有FLT3的過表達(dá)，而FLT3是AML最常見的單基因突變，約17%-30%的患者有FLT3近膜區(qū)串聯(lián)重復(fù)突變(FLT3ITD)，1.6%-7.0%患者有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域

10、點(diǎn)突變(FLT3TKD)，這和患者臨床高白細(xì)胞血征、緩解率低、預(yù)后差密切相關(guān)。FLT3被認(rèn)為是AML極有前景的治療靶點(diǎn)，其靶向抑制深受關(guān)注3,4。 然而FLT3 與其它 型 RTK 受體同源性高，往往不易獲得高選擇性抑制劑5，且據(jù)白血病發(fā)生“二次打擊模型”表明，AML發(fā)生需要兩種基因突變的累加，其中之一突變使細(xì)胞具增殖和存活優(yōu)勢，之二突變干擾了造血分化和之后的細(xì)胞凋亡6，F(xiàn)LT3抑制研究也需要與其它靶向抑制協(xié)同，所以有必要對FLT3抑制方式和方法進(jìn)一步探討。本研究采用體外轉(zhuǎn)錄的方法，合成3個FLT3靶向的短發(fā)夾狀干擾RNA（FLT3small hairpain interfering RNA,

11、FLT3shRNA）,體外轉(zhuǎn)染FLT3過表達(dá)的AML細(xì)胞株THP1，從FLT3的mRNA、蛋白水平評定其干擾效應(yīng)，以篩選出一條效率高的FLT3干擾靶序列，用于FLT3RNAi質(zhì)粒載體構(gòu)建及后續(xù)研究。    材料    THP1細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所,T7 RiboMAXTM Express RNAi System及CodeBreakerTM siRNA Transfection Reagent購自Promerga公司，F(xiàn)LT3shRNA的Oligo單鏈DNA模板、測定引物由上海鼎安合成，TRIzoL購自Invitrogen

12、公司，AMVcDNA第一鏈合成試劑盒購自上海生工生物工程公司，rTaq聚合酶，dNTP等購自TaKaRa公司，鼠抗人單克隆抗體Flt3/Flk2、山羊抗鼠IgG1FITC購自Santa Cruz公司。    細(xì)胞培養(yǎng)    THP1培養(yǎng)于含15%胎牛血清、10 mmol/L HEPES、1.0 mmol/L 丙酮酸鈉、0.05 mol/L 2巰基乙醇、100 U/ml青霉素及鏈霉素的DMEM中，置于37、5% CO2培養(yǎng)箱。實驗細(xì)胞均處于增殖指數(shù)期。    FLT3shRNA的設(shè)計及合成 

13、60;  人源FLT3 mRNA基因在GenBank登錄號是NM004119，全長3 475 bp，在其讀碼框58-3 039 bp內(nèi)，用TaKaRa公司提供siRNA軟件設(shè)計并同源比對，擇定3條靶mRNA干擾序列（附表）。    Table 1.   Targeting interference sequences of mRNA    Targeting sequence    on mRNA (53) Location    (NM0041

14、19)shRNA1GCTGTTCATGTGAACCATG877-895shRNA2GGAGTCTGGAATAGAAAGG1 498-1516shRNA3GAAACGACACCGGATACTA1 022-1040    同時合成3種FLT3shRNA及無關(guān)序列的陰性對照shRNA(negative control shRNA,NCshRNA)。步驟：化學(xué)合成Oligo單鏈DNA模板，退火后形成模板雙鏈,模板終濃度是10 pmol/l。建立20 l反應(yīng)體系，包括 RiboMAX ExpressT7 2×緩沖液10  l、退火DNA Oligo模板2

15、 l、無RNase水6 l、Enzyme Mix 2 l；于37孵育30分鐘后加入1 l的RQ1無核酶DNase,37孵育30分鐘，進(jìn)行生成shRNA純化，用60 l無核酶水溶解。用2.5%瓊脂糖凝膠電泳定量。以1 l退水雙鏈DNA模板作對照，取1 l shRNA產(chǎn)物上樣，根據(jù)吸收峰面積、模板濃度、shRNA和模板分子量計算shRNA濃度。生成shRNA49 bp，其序列為:FLT3shRNA1：5GC UGUUCAUGUGAACCAUGucucuugaaCAUGGUUCA CAUGAACAGCUU3；FLT3shRNA2：5GGAGU CUGGAAUAGAAAGGucucuugaaCCUUU

16、CUAUUCC AGACUCCUU3；FLT3shRNA3：5GAAACGAC ACCGGAUACUAucucuugaaUAGUAUCCGGUGUCG UUUCUU3；NCshRNA：5UUCUCCGAACGUGUCA CGUucucuugaaACGUGACACGUUCGGAGAAUU3。    轉(zhuǎn)染    設(shè)同代培養(yǎng)正常細(xì)胞對照組、NCshRNA組對照組及實驗組，轉(zhuǎn)NCsiRNA/FITC以確定轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞離心后用全培養(yǎng)液調(diào)至4×105/ml，取2.5 ml接種于6孔板中。先將無血清培養(yǎng)液625 l、轉(zhuǎn)染試劑7 l充分混

17、合，室溫靜置20分鐘；再按既定量滴加shRNA，室溫靜置20分鐘；后逐滴加入培養(yǎng)板/瓶的中心部位，前后左右震蕩混勻,放回培養(yǎng)箱，按既定時間收獲細(xì)胞。    mRNA表達(dá)的半定量RTPCR檢測    按TRIzoL常規(guī)提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)合成cDNA第1鏈；以GAPDH作內(nèi)參對照，用RTPCR檢測FLT3 mRNA表達(dá)。引物FLT3: P1 5TCAAGTGC TGTGCATACAATTCCC3； P2 5CACCTGTAC CATCTGTAGCTGGCT3。GAPDH:P1 5GCAC CGTCAAGGCTGAGAA3；P2 5AG

18、GTCCACCA CTGACACGTTG3。FLT3產(chǎn)物長210 bp；GAPDH長570 bp。反應(yīng)體系25 l：ddH2O 19.375 l、10×buffer 2.5 l、dNTP2.0 l、rTaq聚合酶0.125 l、上下游引物各0.25 l(濃度100 ul/ml)、模板cDNA 0.5l。反應(yīng)條件：94預(yù)變性3分鐘；95 30秒，56退火30秒,72延伸40秒,共30個循環(huán),最后72延伸5分鐘，4中止。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)吸收峰面積計算FLT3mRNA相對含量(RC)，RC=FLT3吸收峰面積/內(nèi)參吸收峰面積。先用終濃度25 nmol/L

19、的shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，評定3種shRNA轉(zhuǎn)染24、48及72小時時的干擾效率；后以篩出的shRNA1以5、10、15、20、25 nmol/L梯度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，收集48小時的細(xì)胞，篩選最佳作用濃度。    FLT3蛋白表達(dá)的FCM檢測    以15 nmol/L shRNA1轉(zhuǎn)染，48、72小時時收獲細(xì)胞，經(jīng)鼠抗人單克隆抗體Flt3、鼠抗IgG1FITC分別作用，用PBS洗滌后上FCM測細(xì)胞FLT3蛋白表達(dá)，以PBS代替一抗作陰性對照。上FCM檢機(jī)檢測1×104個細(xì)胞，CellQuest軟件分析。實驗獨(dú)立復(fù)行3次 &#

20、160;  FLT3蛋白亞細(xì)胞定位及表達(dá)的免疫熒光檢測    以15 nmol/L shRNA1轉(zhuǎn)染并收獲72小時細(xì)胞，濃縮后作單層細(xì)胞涂片,自然晾干，用4%多聚甲醛固定，用PBS淋洗后兔血清封閉；傾去血清，用1200稀釋FLT3一抗覆蓋細(xì)胞層，于4在濕盒中過夜；次日PBS淋洗后加1400稀釋IG1FITC二抗，冰上避光孵育40分鐘，PBS淋洗，熒光顯微鏡觀察，同時以PBS代替一抗作陰性對照。實驗獨(dú)立復(fù)行3次。    統(tǒng)計學(xué)處理    FLT3mRNA相對含量(M)=FLT3吸收峰面積/內(nèi)參吸收

21、峰面積，抑制率%=(陰性對照M值-干擾后M值)/ 陰性對照M值×100；采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本資料t檢驗，在SPSS 13.0上完成。    結(jié)    果    NCshRNA及3種FLT3shRNA合成及濃度確定    以T7啟動子介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)錄合成的NCshRNA及3條FLT3shRNA均49 bp，無降解、無彌散，各泳道DNA模板去除完全。以上樣量1 l的 DNA Oligo模板(分子量43 750.05 Da、濃度為10 mol/L)吸光率峰值為1，則泳

22、道1、泳道2、泳道3、泳道5分別為1.01、0.94、0.46、0.76，由此計算出NCshRNA、shRNA1、shRNA2、shRNA3（分子量15 028.0 Da）的濃度分別為29.43、27.43、13.40、22.14 mol/L(圖1)。    siRNA轉(zhuǎn)染效率    將FITC標(biāo)記的NCsiRNA同條件轉(zhuǎn)染，24小時時以熒光顯微鏡觀察，其轉(zhuǎn)染THP1細(xì)胞的效率可達(dá)90%以上(圖2)。    Figure 1.   Analysis of different shRNA

23、 molecules generated by the T7 RiboMAXTM  Express RNAi System and electrophoresis on agarose gel.  Lane 1:NCshRNA. Lane 2:shRNA1. Lane 3:shRNA2. Lane 4:shRNA3. Lane 5:DNA Template. Lane 6:100 bp DNA ladder.    Figure 2.   Transfection efficiency of NCsiRNA/FITC in

24、THP1 cells.     3種FLT3shRNA干擾后FLT3 mRNA的表達(dá)    在24、48、72小時時不同處理組間FLT3 mRNA的相對含量有差異，F(xiàn)24 h=20.034、F48 h=33.912、F72 h=17.882， p0.001；3個時間點(diǎn)正常對照組與NC組相對含量無差異；shRNA2組在24、48小時與對照組無差異，72小時低于對照組（p0.02），而shRNA1、shRNA3與對照組相比在各時間點(diǎn)均有顯著下降，shRNA1下降幅度明顯大于shRNA3（p0.001）,shRNA1最大抑制率是（

25、72.95±2.07）%(圖3)。    不同濃度shRNA1干擾后FLT3 mRNA的表達(dá)    不同濃度處理組間FLT3 mRNA的相對含量有差異（F=38.857，p0.001）。正常組與NC組的FLT3 mRNA相對含量無差異（p0.05）；與對照組比5濃度組FLT3 mRNA均有下降（p0.05），統(tǒng)計學(xué)不支持5 nmol/L與10 nmol/L間，15、20 nmol/L與25 nmol/L之間作用有差異，而后3組mRNA相對含量顯著低于前2組（p0.001），15 nmol/L濃度作用抑制率可達(dá)（67.53&#

26、177;0.66）%（圖4）。    FLT3shRNA1、FLT3shRNA3干擾后FLT3 蛋白表達(dá)    48、72小時不同處理組間THP1細(xì)胞表面FLT3蛋白表達(dá)率有差異（F48 h=59.763、F72 h=161.192， p0.001）；這兩個時間點(diǎn)正常對照組與NC對照組表達(dá)無差異，但shRNA1、shRNA3組均明顯低于對照組，且shRNA1下降明顯大于shRNA3（p0.001）；shRNA1作用72小時FLT3蛋白表達(dá)低于48小時時，p0.05，72小時時shRNA1蛋白抑制率可達(dá)（79.67±0.66）

27、%（圖5）。 討    論    RNA干擾是對哺乳動物進(jìn)行遺傳分析的一種重要工具，除高效性、穩(wěn)定性、可遺傳性外，還具有特異性和靶向性。RNAi只干擾FLT3信號傳導(dǎo)，對其它RTK信號無影響；而不同靶向RNAi能夠同時抑制多個不同基因，且抑制效果互不干擾，這對AML這種多基因疾病研究有其獨(dú)特的優(yōu)勢7,8。人FLT3基因位于13q12, mRNA全長3475 bp，讀碼框于58-3 039 bp內(nèi)，共有24個外顯子，編碼的FLT3受體為含993個氨基酸的跨膜分子，胞外區(qū)5個IgG樣結(jié)構(gòu)是FLT3配體結(jié)合域、跨膜區(qū)是激酶不連續(xù)作

28、用域，胞內(nèi)區(qū)2個分開的激酶結(jié)構(gòu)域是酪氨酸激酶的催化區(qū)域2,9。干擾RNA設(shè)計依據(jù)Harborth原則，作用區(qū)均長19 bp，GC含量為47%，序列中不含有連續(xù)4個或多于4個的T結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)無成莖和成袢現(xiàn)象。有報道提示，5端第1個堿基為G/C，3端堿基為G/C，3端5 bp堿基富含有A/U區(qū)的siRNA最為有效10,11，shRNA1、shRNA2的干擾序列均以G開始和結(jié)尾，3端5個堿基A/U占2個及以上；經(jīng)NCBI同源比對3個shRNA均不存同源靶點(diǎn)。    以T7 RiboMAXTM Express RNAi System體外轉(zhuǎn)錄合成shRNA效率較高，合成N

29、CshRNA、shRNA1、shRNA2、shRNA3的1個反應(yīng)、終產(chǎn)物以60 l無核酸酶水溶解，其濃度分別為11.94、15.72、11.64、17.47 mol/L。用Promerga公司siRNA transfection reagent轉(zhuǎn)染，經(jīng)同條件轉(zhuǎn)染FITC標(biāo)記的NCsiRNA驗證，轉(zhuǎn)染THP1細(xì)胞的效率可達(dá)90%以上。    我們先用終濃度25 nmol/L的shRNA1、shRNA2、shRNA3轉(zhuǎn)染細(xì)胞，據(jù)報道該濃度shRNA可達(dá)其最大干擾效率，半定量RTPCR證實了shRNA1、shRNA3可顯著下調(diào)FLT3 mRNA的表達(dá)，且在24、48、7

30、2小時shRNA1對FLT3 mRNA均有很強(qiáng)的抑制作用,但最強(qiáng)抑制時間是48小時，作用可達(dá)72小時，最大抑制率為（72.95±2.07）%。再者5 nmol/L及以上濃度的shRNA1對其mRNA表達(dá)有下調(diào)作用，作用存在量效關(guān)系，15 nmol/L shRNA1的抑制率為(67.53±0.66)%。    免疫熒光結(jié)果顯示，F(xiàn)LT3蛋白位于細(xì)胞膜上；FCM檢測顯示，shRNA1有較強(qiáng)的FLT3蛋白抑制作用，其作用較強(qiáng)時間點(diǎn)在72小時,蛋白抑制率達(dá)(79.67±0.66)%，免疫熒光檢測也顯示，shRNA1轉(zhuǎn)染72小時細(xì)胞膜上FLT3

31、的熒光強(qiáng)度明顯下降。綜上所述，在設(shè)計的3條FT3shRNA中，以shRNA1具有最強(qiáng)的FLT3靶向抑制作用，且經(jīng)多次實驗證實其作用穩(wěn)定、重復(fù)性好，可作為進(jìn)一步研究該基因機(jī)制及靶向治療可能性的工具，其mRNA靶標(biāo)也可作為今后構(gòu)建FLT3RNAi質(zhì)粒載體的靶序列。    致謝：本課題在河南省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室完成，特此致謝！【參考文獻(xiàn)】  1Ozeki K, Kiyoi H, Hirose Y, et al. Biologic and clinical significance of the FLT3 transcript level in acute my

32、eloid leukemia. Blood, 2004; 103: 1901-19082馬艷萍, 鄒萍, 肖娟等. FLT3和ckit在臍血CD34+干/祖細(xì)胞中功能性表達(dá)及意義. 中國實驗血液學(xué)雜志，2002; 10: 277-2803Gilliland DG, Griffin JD. The roles of FLT3 in hematopoiesis and leukemia. Blood, 2002; 100: 1532-15424Advani AS. FLT3 and acute myelogenous leukemia: biology, clinical significance and therapeutic applications. Curr Pharm Des, 2005; 11: 3449-34575