三七總皂甙對(duì)梗阻性黃疸肝組織中baxbcl(1)

1、    三七總皂甙對(duì)梗阻性黃疸肝組織中bax，bcl(1)    】 目的：探討梗阻性黃疸肝損傷中的病理調(diào)控機(jī)制及三七總皂甙(PNS)的保護(hù). 方法：健康日本大耳白兔48只，雌雄各半，隨機(jī)分為2組，每組24只. A組：膽總管接扎組（BDL）；B組：BDL PNS組. 建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型. 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在相同條件下飼養(yǎng). 采用免疫組化法檢測(cè)肝組織bax，bcl2的表達(dá)情況. 結(jié)果： A組動(dòng)物在膽道梗阻后，肝組織可見bcl2和bax蛋白表達(dá)， bax蛋白在梗阻9 d達(dá)高峰，此后開始下降. 而bcl2蛋白在梗阻21 d達(dá)

2、高峰. 凋亡指數(shù)（AI）隨bax升高而升高，隨bcl2的升高而降低；B組動(dòng)物bax表達(dá)較同時(shí)相A組弱，而bcl2蛋白強(qiáng)于A組，B組AI值較A組降低. 結(jié)論：梗阻性黃疸所致的肝組織病理變化可能與凋亡程序的啟動(dòng)有關(guān). PNS對(duì)梗阻性黃疸肝組織損傷有明顯的保護(hù)作用,其機(jī)制可能是與上調(diào)肝組織bcl2蛋白及下調(diào)bax蛋白有關(guān).【關(guān)鍵詞】 阻塞性黃疸； bax； bcl2； 三七總皂甙；肝；兔    0引言梗阻性黃疸是外科的常見病癥，肝臟是最先受損并損傷最重的器官. 本實(shí)驗(yàn)我們通過(guò)檢測(cè)梗阻性黃疸大耳白兔肝組織bax，bcl2蛋白在不同時(shí)期的表達(dá)情況，同時(shí)給予三七總皂

3、甙（Panax notoginoside, PNS）干預(yù)，探討梗阻性黃疸肝損傷的病理調(diào)控機(jī)制及藥物保護(hù).1材料和方法1.1材料日本大耳白兔72只，體質(zhì)量1.82.5 kg，雌雄各半，蘭州生物制品研究所提供. bax, bcl2免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司. PNS由山西三九萬(wàn)榮藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，批號(hào)20020628.1.2.1分組將48只日本大耳白兔，雌雄各半，隨機(jī)分為2組，每組24只. A組：膽總管接扎組（BDL）；B組：BDL PNS組. 分別于術(shù)后3，6，9，21 d每組隨機(jī)取6只處死取材.1.2.2模型制作BDL組：20 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg,ip)麻

4、醉，距膽總管起始部位1 cm處雙重結(jié)扎. BDL PNS組：自膽總管結(jié)扎術(shù)日起腹腔注射PNS 25 mg/kg，1次/d，至取材.1.2.3觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法肝組織的病理變化： 剪取肝右葉組織約5 mm×5 mm×4 mm大小，置于40 g/L多聚甲醛固定，然后脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4 m厚的石蠟片， HE染色，顯微鏡觀察病理變化. 肝功能檢測(cè)：分別于術(shù)后3，6，9，21 d將各組大耳白兔取材，自下腔靜脈取血3.0 mL，4，3000 r/min離心10 min后取上層血清測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、血清白蛋白（ALB）. bax，bcl2的免疫組

5、化檢測(cè):先剖腹剪取肝右葉組織,約5 mm×5 mm×4 mm大小，置于40 g/L多聚甲醛固定24 h，后依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋，然后切成4 m厚的石蠟片，貼片后行免疫組化染色. 染色操作步驟：抗生物素鏈酶親合素復(fù)合物法（SABC）. 切片脫蠟至水，30 mL/L H2O2處理，微波擋修復(fù)抗原20 min滴加正常山羊血清10 min，滴加一抗，濕盒內(nèi)4孵育20 h，0.01 mol/L PBS洗2×3次，滴加生物素兔化山羊抗兔IgG 37孵育20 min，0.01 mol/L PBS洗2×3次，滴加SABC復(fù)合物37孵育20 min，0.01 m

6、ol/L PBS洗5×4次，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，雙蒸水終止反應(yīng)，蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片、顯微鏡觀察. 結(jié)果判斷和數(shù)據(jù)處理采用網(wǎng)格測(cè)試法. 細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性細(xì)胞，染色結(jié)果綜合染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量?jī)蓚€(gè)方面進(jìn)行半定量分析，分別評(píng)分03分. 染色強(qiáng)度：陰性（0分）；淺黃色（1分）；棕黃色（2分）；棕褐色（3分）. 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：無(wú)著色細(xì)胞（0分）；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1/3（1分）；1/32/3 (2分)；大于2/3 (3分). 根據(jù)兩項(xiàng)結(jié)果相加分?jǐn)?shù)判斷結(jié)果：0分（-）；2分（±）；3分（ ）；4分(）；5分(）. 每例切片觀察5個(gè)高倍（×40

7、0）視野（向同一方向移動(dòng)切片，不重復(fù)，不重疊）作為觀察區(qū)，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陰性與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，最后計(jì)算陽(yáng)性百分率，即AI，AI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 陰性細(xì)胞數(shù)）.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以x±s表示. 組間觀測(cè)指標(biāo)隨時(shí)相變化比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05.    2結(jié)果2.1術(shù)后一般狀況及取材時(shí)肉眼觀察A組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于膽總管結(jié)扎手術(shù)后12 h出現(xiàn)尿色加深，術(shù)后2 d出現(xiàn)皮膚及鞏膜黃染，大便顏色變淺，隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，食欲及精神減退，反應(yīng)逐漸遲鈍，皮膚及鞏膜黃染進(jìn)一步加重. 取材時(shí)

8、見肝臟明顯增大，邊緣變鈍，顏色逐漸由暗紅轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色，質(zhì)地由軟變硬. 術(shù)后21 d取材時(shí)見有腹水，肝臟表面呈結(jié)節(jié)樣改變. B組皮膚鞏膜黃染較輕，發(fā)生時(shí)間較晚；肝臟表面結(jié)節(jié)較小量少.            作者：周斌，于博，姚南，宋少莉 【關(guān)鍵詞】阻塞性黃疸；,bax；,bcl【Abstract】 AIM：To explore the protective mech         本篇論文是由3C

9、OME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。2.2光鏡下形態(tài)學(xué)改變A組動(dòng)物于膽總管接扎3 d即見肝細(xì)胞輕度水腫，肝內(nèi)膽管擴(kuò)張，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見少量細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為肝細(xì)胞嗜酸性變，細(xì)胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)向核仁或核周邊聚集；結(jié)扎6 d，肝細(xì)胞輕至中度水腫，纖維組織增生，膽小管擴(kuò)張及中度增生，膽栓形成，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，細(xì)胞凋亡增加；結(jié)扎9 d，肝細(xì)胞中度水腫，部分細(xì)胞脂肪變性，可見再生的肝細(xì)胞，匯管區(qū)膠原結(jié)締組織明顯增生并向肝小葉內(nèi)擴(kuò)展，細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰，可見嗜

10、酸性小體（圖1A）；結(jié)扎21 d，肝臟結(jié)構(gòu)廣泛改變，細(xì)胞凋亡有所減少，肝假小葉形成，肝索變窄，肝竇增寬，大部分肝細(xì)胞胞質(zhì)濃縮，部分肝細(xì)胞變性壞死. B組與同時(shí)期A組比較，肝細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肝纖維化程度均較輕（圖1B）.A: 膽總管結(jié)扎9 d; B: 膽總管結(jié)扎 注射三七總皂甙9 d.圖1大耳白兔肝組織形態(tài)學(xué)改變HE ×4002.3肝功能的變化A組和B組的血清TBIL和ALT隨膽道梗阻的時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，而白蛋白逐漸下降. B組與A組ALT比較明顯降低（P<0.05,表1）.2.4各組肝組織bax，bcl2的表達(dá)及與AI的關(guān)系膽道結(jié)扎后，肝臟可見bcl2和bax蛋白表達(dá)

11、. 表達(dá)最多的是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)，枯否細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá). bax蛋白于結(jié)扎3 d即有表達(dá)，結(jié)扎9 d達(dá)高峰，此后開始下降. 而bcl2蛋白在梗阻21 d表達(dá)最明顯. AI于結(jié)扎3 d開始升高，隨bax的表達(dá)增強(qiáng)而上升，于結(jié)扎9 d達(dá)高峰，此后隨bcl2的表達(dá)增強(qiáng)而下降，于21 d降至最低. PNS干預(yù)組的大耳白兔肝組織bax蛋白較同時(shí)相單純結(jié)扎組明顯下調(diào)，bcl2蛋白較同時(shí)相單純結(jié)扎組上調(diào)，凋亡指數(shù)較低（表2,3）.表1術(shù)后各組血清TBIL, ALT及ALB含量變化表2各組肝組織bax，bcl2表達(dá)評(píng)分表3各組肝組織AI值3討論bax和bcl2基因是目前最受關(guān)注的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，通過(guò)

12、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，bcl2對(duì)細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，而bax拮抗bcl2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡1. 本實(shí)驗(yàn)提示bcl2和bax可能多以二聚體的形式調(diào)控肝細(xì)胞凋亡. 膽道梗阻9 d前bax同二聚體的數(shù)量增多，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，AI值較高；而9 d后bcl2增多，促進(jìn)形成bcl2/bax異二聚體，并使bcl2同二聚體的量增多，從而抑制細(xì)胞凋亡，AI值降低. 梗阻性黃疸肝損傷發(fā)生細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制為：鈣超載. 梗阻性黃疸時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸含量明顯上升，肝細(xì)胞內(nèi)線粒體受損，使肝細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化產(chǎn)能減少，導(dǎo)致了肝細(xì)胞生物膜損傷、鈣泵功能喪失，胞內(nèi)Ca2 升高，觸發(fā)細(xì)胞凋亡. 氧自由基致?lián)p傷.

13、膽道梗阻后肝臟氧自由基增多，氧自由基能夠?qū)е翫NA、蛋白質(zhì)、脂膜的氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡2. 氧自由基增多的原因一是肝臟有效血流量明顯減少，缺氧導(dǎo)致線粒體呼吸鏈電子傳遞障礙，結(jié)果產(chǎn)生大量氧自由基；二是自由基清除酶系在體內(nèi)合成減少，自由基清除能力下降；三是膽鹽阻礙線粒體呼吸鏈的電子傳遞，增加電子外泄率，促進(jìn)氧自由基的形成3. 炎性細(xì)胞浸潤(rùn). 膽道梗阻后，由于腸道膽鹽缺乏，清除內(nèi)毒素的能力下降，大量?jī)?nèi)毒素吸收入血，形成腸源性內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素具有刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF等的作用. 而肝細(xì)胞功能受損，對(duì)TNF等細(xì)胞因子滅活能力下降，使這些細(xì)胞因子在血液及組織中持續(xù)升高4. TNF可能通過(guò)激活細(xì)胞C

14、a2Mg2依賴的限制性核酸內(nèi)切酶，導(dǎo)致基因組DNA分子降解為寡聚核苷酸片段，引發(fā)細(xì)胞凋亡5-6.PNS主包含人參二醇型皂甙Rb1、人參三醇型皂甙Rg1和三七皂甙R1. 實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)PNS是一種選擇性的慢鈣通道阻滯劑，它能減少自由基的產(chǎn)生和清除已產(chǎn)生的自由基，對(duì)心、肝、腎缺血性再灌注損傷中有明顯的保護(hù)作用7；PNS有肝保護(hù)和抗肝纖維化作用8. 另外，它還有抗炎作用. 李曉輝等9報(bào)道PNS具有良好抗炎活性，其機(jī)制與抑制炎性細(xì)胞因子TNF及NO水平的升高有密切關(guān)系,發(fā)現(xiàn)膽總管結(jié)扎后隨著膽紅素水平的逐漸升高，肝臟病理?yè)p傷加重，肝臟合成蛋白的能力下降，表現(xiàn)為ALT的值升高，ALB的下降. 但是PNS干預(yù)

15、組的大耳白兔肝組織病理?yè)p害較同時(shí)期未干預(yù)組輕，ALT較低，ALB較高，而且其bax蛋白較同時(shí)相單純結(jié)扎組大耳兔明顯下調(diào)，bcl2蛋白較同時(shí)相單純結(jié)扎組上調(diào)，AI值較同時(shí)相單純結(jié)扎組降低, 說(shuō)明PNS對(duì)梗阻性黃疸肝細(xì)胞的凋亡有抑制作用, 其原因可能為PNS作為一種鈣通道阻滯劑，能阻滯細(xì)胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而減少凋亡的啟動(dòng)，使肝細(xì)胞凋亡減少;自由基是一種凋亡刺激因子，PNS能減少自由基的產(chǎn)生和清除已產(chǎn)生的自由基，從而減少肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生;PNS可能通過(guò)其抗炎作用減輕內(nèi)毒素血癥和細(xì)菌移位對(duì)肝細(xì)胞等的損害，從而減少凋亡的啟動(dòng).我們推測(cè)，PNS可能通過(guò)抑制肝細(xì)胞的凋亡來(lái)發(fā)揮其保護(hù)作用，其機(jī)制可能是與上調(diào)肝組織

16、bcl2蛋白及下調(diào)肝組織bax蛋白有關(guān).【參考文獻(xiàn)】1 Wolter KG, Hsu YT, Smith CL, et al. Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosisJ. J Cell Biol, 1997, 139(5):1281-1292.2 范作文，王均志，黃從新.線粒體與心肌細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展J. 中華心血管雜志，2002, 30（5）：317-318.3 張永剛，遲彥邦，楊彤翰.粉防己堿對(duì)膽汁性肝纖維化保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究 J. 中華肝膽外科雜志，1999, 5（5）：317-320.4 李端陽(yáng)

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