大鼠肝癌細(xì)胞表面特標(biāo)記與成瘤能力有關(guān)(1)

1、    大鼠肝癌細(xì)胞表面特標(biāo)記與成瘤能力有關(guān)(1)    】 目的：研究大鼠肝癌細(xì)胞表面標(biāo)記特征與成瘤能力關(guān)系. 方法：二乙基亞硝胺為誘癌劑制造大鼠肝癌模型，分離培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，按照卵圓細(xì)胞表面標(biāo)記（CD34,cKit,Thy1,AFP，CK7，CK8,CK14,CK18,CK19和GGT）分選腫瘤細(xì)胞，比較各個(gè)表面標(biāo)記陽性腫瘤細(xì)胞亞群與陰性腫瘤細(xì)胞亞群移植裸鼠后成瘤能力差異，并且對數(shù)稀釋成瘤能力強(qiáng)的細(xì)胞亞群，分析低密度下強(qiáng)成瘤能力細(xì)胞亞群與相應(yīng)陰性細(xì)胞亞群成瘤差異. 結(jié)果： CD34,Thy1,CK7,CK8,AF

2、P和GGT等6個(gè)標(biāo)記的陽性與陰性腫瘤細(xì)胞移植裸鼠后，成瘤能力差異顯著(P<0.05或0.01)；1/1001/10細(xì)胞密度的CK7陰性與AFP陽性細(xì)胞亞群成瘤能力仍然比其對應(yīng)細(xì)胞亞群為高. 結(jié)論：大鼠原發(fā)性肝癌腫瘤細(xì)胞中存在成瘤能力差異巨大的腫瘤細(xì)胞亞群. CK7(-)和AFP( )，可能是大鼠肝癌干細(xì)胞的部分表面標(biāo)記特征.【關(guān)鍵詞】 肝腫瘤；干細(xì)胞；表面標(biāo)記0引言腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cells, TSC)是近年腫瘤科學(xué)研究的熱點(diǎn). TSC來源于相應(yīng)的成體干細(xì)胞，是腫瘤發(fā)生、擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)1-3. 目前肝癌干細(xì)胞的研究報(bào)道很少. 我們知道，卵圓細(xì)胞（oval cells,

3、 OVC）不僅具備基本的肝干細(xì)胞性質(zhì)，而且與肝癌發(fā)生關(guān)系密切，是最接近肝癌干細(xì)胞的成體干細(xì)胞. 我們通過OVC表面標(biāo)記分選肝癌腫瘤細(xì)胞，了解不同肝癌細(xì)胞亞群的裸鼠成瘤能力，探索肝癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記特征.1材料和方法1.1材料雄性清潔級SD大鼠8只， 8 wk大，體質(zhì)量（233.8±24.5）g，雄性裸小鼠(BALB/cnu/nu)，46 wk，體質(zhì)量1520 g，由南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供. 飼養(yǎng)溫度2225，濕度（50±5）%，在正常光照及自由攝食條件下飼養(yǎng)于普通飼養(yǎng)室，裸小鼠飼養(yǎng)于SPF級飼養(yǎng)室. RPMI 1640與胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品; 二乙基亞硝胺

4、及胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品;一抗CD34, cKit,Thy1,AFP,CK7,CK8,CK14,CK18,CK19和GGT購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司.1.2方法以二乙基亞硝胺為誘癌劑，70 mg/kg加入飼料中，每周1次，室溫2528. 誘癌至12 wk時(shí)改喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，共18 wk. 大鼠出現(xiàn)明顯肝癌癥狀，瀕臨死亡時(shí)提前取標(biāo)本. 大鼠誘癌成功后，無菌下取腫瘤組織約1 mm3，置于含青霉素的無菌RPMI 1640培養(yǎng)液中，用生理鹽水漂洗2次，剪碎，放入2.5 g/L胰蛋白酶消化液. 細(xì)胞消化液經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，用完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液常規(guī)培養(yǎng). 采用OVC 10個(gè)表面標(biāo)記物（C

5、D34，cKit，Thy1，AFP，CK7，CK8，CK14，CK18，CK19和GGT）作為分選腫瘤細(xì)胞的特征標(biāo)記. 親和板結(jié)合分離法分選腫瘤細(xì)胞. 將100 L純化的羊抗鼠IgG加入到無菌塑料平皿中，再加緩沖液3 mL混勻，4過夜，次日吸棄上清液， PBS洗去多余的抗體，含10 mL/L小牛血清PBS室溫下孵育，PBS洗3次，4保存?zhèn)溆? 取腫瘤細(xì)胞，每1×106個(gè)細(xì)胞加入各OVC表面標(biāo)記工作液100 L,4作用1 h,培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，(1.52)×107個(gè)加入到上面準(zhǔn)備好的塑料平皿中， Hanks液稀釋為3 mL,輕輕搖勻，4 1 h（20 min搖1次）. 取懸液中

6、細(xì)胞標(biāo)記為陰性細(xì)胞，洗脫黏附在塑料平皿的腫瘤細(xì)胞，標(biāo)記為陽性細(xì)胞，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng). 調(diào)整腫瘤細(xì)胞（陽性細(xì)胞或陰性細(xì)胞）密度為5×1010L，取0.2 mL細(xì)胞懸液注射到裸鼠腋背部皮下，觀察裸鼠移植腫瘤生長情況，1 mo裸鼠移植腫瘤測質(zhì)量. 對致瘤能力強(qiáng)的腫瘤亞群進(jìn)行對數(shù)稀釋（1/100或1/10）后，取0.2 mL細(xì)胞懸液注射到裸鼠腋背部皮下，1 mo測量移植腫瘤質(zhì)量，了解強(qiáng)致瘤腫瘤細(xì)胞亞群低細(xì)胞密度下致瘤能力.    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：各組肝癌細(xì)胞亞群成瘤能力以腫瘤細(xì)胞移植裸鼠后形成腫瘤質(zhì)量表示，均通過SPSS 10.0軟件進(jìn)行配對t檢驗(yàn). P<

7、;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果CD34，Thy1，CK7，CK8，AFP和GGT等6個(gè)標(biāo)記的陽性與陰性腫瘤細(xì)胞移植裸鼠1 mo后，成瘤能力差異顯著(P<0.05)，而按照CK7， Thy1與AFP這2個(gè)表面標(biāo)記分選的腫瘤細(xì)胞亞群成瘤能力差異尤其明顯（P<0.01,表1）. 將成瘤能力差異顯著的陽性與陰性腫瘤細(xì)胞（CD34,Thy1,CK7,CK8,AFP和GGT）進(jìn)行對數(shù)稀釋，1 mo后觀察發(fā)現(xiàn)，高致瘤亞群CK7（-）和AFP( )在1/10密度接種條件下，成瘤比例保持在100%，仍然大大高于原密度接種的對應(yīng)低致瘤亞群細(xì)胞CK7（ ）和AFP(-)；甚至在1/100密度接種條

8、件下，這2個(gè)細(xì)胞亞群仍然有一定的成瘤比例. 高致瘤亞群Thy1( )也有較高的成瘤比例，但是較CK7（-）和AFP( )稍弱. CD34 ( )，CK8 ( )與GGT ( )亞群對數(shù)稀釋后成瘤比例大幅度下降，比對應(yīng)低致瘤亞群細(xì)胞原密度接種條件下的成瘤比例低（表2）.            【關(guān)鍵詞】,肝腫瘤Relationship between surface markers characteristic and tumorigenic ability in rat he

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10、SC，和另一個(gè)可最終分化為包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞的子細(xì)胞，其結(jié)果是維持TSC數(shù)目穩(wěn)定并產(chǎn)生腫瘤. 大量的證據(jù)表明，TSC起源于相對應(yīng)的成體干細(xì)胞4. OVC不僅是肝臟干細(xì)胞的子代細(xì)胞，也是肝癌發(fā)生的前體細(xì)胞. OVC經(jīng)致癌劑或癌基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后可形成肝細(xì)胞癌、膽管上皮癌和未分化癌. OVC是肝細(xì)胞癌、膽管上皮癌的祖細(xì)胞，與肝腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系. 所有癌組織內(nèi)顯示cHaras基因表達(dá)陰性，而癌旁組織內(nèi)則可見ras基因的大量表達(dá)，證實(shí)了OVC是宿主受化學(xué)致癌劑作用后發(fā)生肝癌的始動細(xì)胞5. 大鼠肝臟出現(xiàn)大量的OVC將不可避免地發(fā)展成肝細(xì)胞癌. OVC是肝癌前體細(xì)胞. OVC存在于人類慢性肝病的

11、肝臟組織中，也存在于人類肝細(xì)胞癌和癌旁組織中6.我們采用OVC的表面標(biāo)記分選肝癌細(xì)胞，研究不同肝癌細(xì)胞亞群的裸鼠成瘤能力，發(fā)現(xiàn)存在一定的差別. 其中CD34，Thy1，CK7，CK8，AFP和GGT等6個(gè)標(biāo)記的陽性與陰性腫瘤細(xì)胞移植裸鼠后，成瘤能力差異顯著，而按照AFP，CK7與Thy1這3個(gè)表面標(biāo)記分選的腫瘤細(xì)胞亞群成瘤能力差異尤其明顯. 在1/100細(xì)胞密度下， AFP（ ）與CK7（-）腫瘤細(xì)胞亞群成瘤能力仍強(qiáng)于對應(yīng)陰性或陽性腫瘤細(xì)胞亞群，說明AFP（ ）與CK7（-）腫瘤細(xì)胞亞群具備非常大的成瘤能力，具備一定的TSC特征，表明AFP（ ）與CK7（-），甚至Thy1（ ），是大鼠肝癌T

12、SC的部分可能表面標(biāo)記，對肝癌TSC的最終分離與鑒定具有重的意義.【參考文獻(xiàn)】1 Pardal R, Clarke MF, Morrison SJ. Applying the principles of stemcell biology to cancerJ. Nat Rev Cancer,2003,3(12):895-902.2 Behbod F, Rosen JM. Will cancer stem cells provide new therapeutic targets J? Carcinogenesis, 2005，26(4):703-711.3 Nakano I, Hemmati

13、HD, Kornblum HI.Cancer stem cells in pediatric brain tumorsJ. No Shinkei Geka,2004，32(8):827-834.4 AlHajj M, Becker MW, Wicha M,et al. Therapeutic implications of cancer stem cellsJ. Curr Opin Genet Dev,2004，14(1):43-47.5 BeckerR,Luthgens B,Oesch F,et al.Haras val 12 but not p53 Ser247 leads to a significant neoplastic tr