腸道致病菌的分離與鑒定

1、腸道致病菌的分離與鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）掌握腸道致病菌的分離、鑒定的主要步驟（2）掌握平板劃線分離法（3）掌握玻片凝集試驗(yàn)的操作方法以及實(shí)際意義二、實(shí)驗(yàn)材料（1 ）實(shí)驗(yàn)儀器：試管、玻片、酒精燈、接種針、接種環(huán)、試管架、（2）實(shí)驗(yàn)試劑：生理鹽水、細(xì)菌培養(yǎng)基、傷寒診斷血清、伊 紅美藍(lán)培養(yǎng)基（）、克氏雙糖鐵培養(yǎng)基（）、葡萄糖發(fā)酵管、乳糖 發(fā)酵管、甘露醇發(fā)酵管、尿素培養(yǎng)基、蛋白胨水、半固體培養(yǎng)基三、實(shí)驗(yàn)流程（1）腸道致病菌的分離 待測(cè)標(biāo)本的制作：把接種環(huán)放置于點(diǎn)燃的酒精燈火焰處對(duì) 其進(jìn)行滅菌，用已滅菌的接種環(huán)在細(xì)菌培養(yǎng)基中取少量待測(cè)細(xì)菌 于盛有5生理鹽水的試管中，混勻。 細(xì)菌的分離接種：用接種環(huán)取適量

2、配置好的細(xì)菌懸液，在酒精燈附近進(jìn)行劃線分離法接種細(xì)菌于培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基置于37C培養(yǎng)1824小時(shí)。（2）腸道致病菌的純化 單菌落接種：從已培養(yǎng)待測(cè)細(xì)菌的培養(yǎng)基上用已滅菌的接 種針挑取某單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基上，一部分直接深入培養(yǎng)基中 底部，一部分直接涂抹于斜面處，置于 37C培養(yǎng)1824小時(shí)。 待測(cè)細(xì)菌的初步判斷：取出已純化培養(yǎng)待測(cè)細(xì)菌的培養(yǎng)基， 觀察現(xiàn)象，初步斷定該細(xì)菌是致病菌或是非致病菌。（3）腸道致病菌的鑒定 生化鑒定：分別取葡萄糖、乳糖、甘露醇發(fā)酵管各一只（注意管內(nèi)的小倒管則應(yīng)充滿液體，不含氣泡），用已滅菌的接種針取已培養(yǎng)的培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物接種于各發(fā)酵管，將各發(fā)酵管于37C培養(yǎng)1824小

3、時(shí)。取出并觀察記錄現(xiàn)象。（注意每次使用接 種針前都應(yīng)用酒精燈火焰進(jìn)行滅菌） 動(dòng)力檢查：用已滅菌的接種針取培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物分別接 種于蛋白胨水、尿素培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基中，將各個(gè)培養(yǎng)基于 37C培養(yǎng)1824小時(shí)。取出后將靛基質(zhì)（吲哚）加入到蛋白胨水 培養(yǎng)基中，并觀察記錄現(xiàn)象。（注意每次使用接種針前都應(yīng)用酒 精燈火焰進(jìn)行滅菌） 血清學(xué)鑒定：取潔凈玻片一張，將其用蠟筆分為兩格，兩邊各取生理鹽水一滴，再用已滅菌的接種環(huán)分別取培養(yǎng)基上的培 養(yǎng)物加入兩格中，與生理鹽水混勻不攤開。（注意每次使用接種環(huán)前都應(yīng)用酒精燈火焰進(jìn)行滅菌） 然后在第二格中滴入一滴傷寒 診斷血清，混勻不攤開，輕輕搖動(dòng)玻片，經(jīng)12觀察兩格

4、中有無(wú)凝集現(xiàn)象。注：本實(shí)驗(yàn)涉及細(xì)菌接種都應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，由于條件有限，因而可在燃燒的酒精燈附近進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（1）培養(yǎng)基現(xiàn)象與分析： 培養(yǎng)基下部呈現(xiàn)黑色現(xiàn)象，上部培養(yǎng)基仍為紅色，培養(yǎng)基 斜面有細(xì)菌明顯蔓延生長(zhǎng)。 分析：培養(yǎng)基下部出現(xiàn)黑色現(xiàn)象，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解培養(yǎng)基中的物質(zhì)并產(chǎn)出硫化氫氣體，由于培養(yǎng)基中含鐵，因而硫化氫能夠與其結(jié)合成硫化鐵，出現(xiàn)黑色現(xiàn)象；而上部因重力含鐵量 較少，產(chǎn)生的硫化氫氣體又部分揮發(fā)， 只有少部分能夠與少量鐵 結(jié)合，故產(chǎn)生的現(xiàn)象不明顯，上部仍呈現(xiàn)紅色。(2) 生化鑒定現(xiàn)象與分析： 葡萄糖發(fā)酵管：管內(nèi)培養(yǎng)基指示劑由紫色變成黃色，其內(nèi) 可見(jiàn)細(xì)菌有明顯生長(zhǎng)

5、現(xiàn)象，無(wú)氣泡產(chǎn)生。分析：培養(yǎng)基指示劑由紫色變成黃色， 說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解葡萄 糖并產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，使得指示劑內(nèi)化學(xué)物質(zhì)發(fā)生顏色改變。 乳糖發(fā)酵管：管內(nèi)培養(yǎng)基指示劑顏色不發(fā)生改變，仍為紫色，有明顯細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象，無(wú)氣泡產(chǎn)生。分析：培養(yǎng)基指示劑不發(fā)生顏色改變， 說(shuō)明該細(xì)菌能分解乳糖但 不能產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，使得管內(nèi)指示劑無(wú)明顯現(xiàn)象。 甘露醇發(fā)酵管：管內(nèi)培養(yǎng)基指示劑由紫色變成黃色，其內(nèi) 可見(jiàn)細(xì)菌有明顯生長(zhǎng)現(xiàn)象，無(wú)氣泡產(chǎn)生。分析：培養(yǎng)基指示劑由紫色變成黃色， 說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解甘露 醇并產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，使得指示劑內(nèi)化學(xué)物質(zhì)發(fā)生顏色改變。(3) 動(dòng)力檢查現(xiàn)象與分析： 尿素培養(yǎng)基：管內(nèi)培養(yǎng)基指示劑顏色無(wú)明顯變化，但

6、有明 顯氣泡產(chǎn)生，有明顯細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象。分析：管內(nèi)培養(yǎng)基指示劑無(wú)明顯顏色改變， 說(shuō)明該細(xì)菌不能分解 尿素，但培養(yǎng)基中其他物質(zhì)成分可以使細(xì)菌分解產(chǎn)氣， 因而產(chǎn)生 氣泡。 蛋白胨水：管內(nèi)指示劑顏色無(wú)明顯變化，有明顯細(xì)菌生長(zhǎng) 現(xiàn)象，無(wú)氣泡產(chǎn)生。加入靛基質(zhì)（吲哚）試劑后不出現(xiàn)玫瑰紅色。 分析：加入靛基質(zhì)指示劑后不呈現(xiàn)玫瑰紅色， 說(shuō)明該細(xì)菌不能分 解培養(yǎng)基中的色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)， 因而靛基質(zhì)指示劑不能與之發(fā) 生化學(xué)反應(yīng)，出現(xiàn)顏色變化。 半固體培養(yǎng)基：管內(nèi)指示劑顏色無(wú)明顯變化，有明顯細(xì)菌 沿穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)現(xiàn)象，無(wú)氣泡產(chǎn)生。分析：細(xì)菌能夠沿穿刺線生長(zhǎng)，說(shuō)明該細(xì)菌有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，有 助于鑒別細(xì)菌種類。（4）血清學(xué)

7、鑒定現(xiàn)象與分析： 現(xiàn)象：通過(guò)玻片兩邊對(duì)比，在加有傷寒桿菌診斷血清的第 二個(gè)格子中周圍液體清澈， 有明顯凝集現(xiàn)象；另一格液體表面渾 濁，無(wú)凝集現(xiàn)象。 分析：第二格中加入傷寒桿菌診斷血清出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，說(shuō) 明接種細(xì)菌應(yīng)為傷寒桿菌，二者特異性結(jié)合產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合 物，因而呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象；而第一格中未加入傷寒桿菌診斷血清，接種細(xì)菌無(wú)相應(yīng)抗體，不能產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物， 所以不呈現(xiàn)凝 集現(xiàn)象。綜上：葡萄糖甘露醇乳糖靛基質(zhì)硫化氫尿素分解動(dòng)力現(xiàn)象+一一+ + +一+由此判斷：該細(xì)菌應(yīng)為乙型副傷寒桿菌。五、實(shí)驗(yàn)總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)所需材料較多，實(shí)驗(yàn)流程較復(fù)雜，需要?jiǎng)邮植僮鞯?步驟較頻繁，因而在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要多加注意操作方法。 在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前應(yīng)熟悉掌握實(shí)驗(yàn)的操作步驟及流程，了解 實(shí)驗(yàn)操作的方法，以便實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)應(yīng)在無(wú)菌操作下進(jìn)行，如可在燃燒的酒精燈附近進(jìn) 行細(xì)菌接種（注意酒精燈安全，切勿灼燒自己或是實(shí)驗(yàn)儀器，防 止事故的發(fā)生）。 細(xì)菌的培養(yǎng)應(yīng)在適宜的環(huán)境下進(jìn)行，避免外界環(huán)境影響 細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖（由于實(shí)驗(yàn)室已配備培養(yǎng)箱，