Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得及蛋白酶控制

1、Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得  生物通編者按：甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)有不少優(yōu)點(diǎn)，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)最為人熟知，并廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)。雖然說(shuō)酵母表達(dá)操作簡(jiǎn)單表達(dá)量高，但是在實(shí)際操作中，并不是每個(gè)外源基因都能順利得到高表達(dá)的。不少人在操作中會(huì)遇到這樣那樣的問(wèn)題，生物通編者特地收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個(gè)被譽(yù)為最簡(jiǎn)單的畢赤酵母表達(dá)的經(jīng)典試劑盒過(guò)程中的心得體會(huì)。其中Xiang Yang是來(lái)自美國(guó)喬治城大學(xué)（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lomba

2、rdi Cancer Center），部分用戶來(lái)自國(guó)內(nèi)。甲基酵母部分優(yōu)點(diǎn)與其他真核表達(dá)系統(tǒng)比較與原核表達(dá)系統(tǒng)比較1.屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達(dá)優(yōu)點(diǎn)-+2.AOX強(qiáng)效啟動(dòng)子，外源基因產(chǎn)物表達(dá)量高，可以達(dá)到每升數(shù)克表達(dá)產(chǎn)物的水平+3.酵母培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，遠(yuǎn)較真核系統(tǒng)簡(jiǎn)單，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。+=4.可以誘導(dǎo)表達(dá)，也可以分泌表達(dá)，便于產(chǎn)物純化。=+5.可以甲醇代替IPTG作為誘導(dǎo)物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工業(yè)產(chǎn)物替代葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本低+ 表示優(yōu)勝于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Exp

3、ression System產(chǎn)品性能：優(yōu)點(diǎn)使用簡(jiǎn)單，表達(dá)量高，His-tag便于純化缺點(diǎn)酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問(wèn)題全面產(chǎn)品報(bào)告及心得體會(huì)：    巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達(dá)重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達(dá)出來(lái)的蛋白可以進(jìn)行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長(zhǎng)速度快，可以將表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。    畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ在多克隆位點(diǎn)（MCR）3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測(cè)和純化，而且在MC

4、R5'端引入了alpha factor（-factor）用以增加表達(dá)，并且在表達(dá)后-factor可以自動(dòng)被切除。在進(jìn)行克隆的時(shí)候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標(biāo)蛋白中增加兩個(gè)氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標(biāo)記，而誘導(dǎo)表達(dá)的載體需要甲醇甲醇比一般用于大腸桿菌表達(dá)誘導(dǎo)使用的IPTG便宜。第一步構(gòu)建載體Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點(diǎn)可供選擇，同時(shí)也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。紅葉山莊：有關(guān)是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在原核表達(dá)，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用

5、 抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點(diǎn)，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽(yáng)性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對(duì)于大小合適（3050KD）的蛋白在產(chǎn)量上是pPIC9K無(wú)法比擬的。leslie：要做畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)，首先當(dāng)然就要了解這個(gè)可愛(ài)的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛(ài)），她和大腸桿菌長(zhǎng)得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過(guò)程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測(cè)。大家做畢赤表達(dá)的時(shí)候應(yīng)該都遇過(guò)這種情況吧，表達(dá)過(guò)程中染菌（我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)污染過(guò)各種顏色形狀的細(xì)菌，那真是一段可怕的經(jīng)歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就

6、是浪費(fèi)大把的時(shí)間了。基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長(zhǎng)的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長(zhǎng)的周期等等情況后，當(dāng)然更多的精力還是應(yīng)該花在表達(dá)的目的蛋白上，我的表達(dá)蛋白有些恐怖，有100KD，本來(lái)當(dāng)然應(yīng)該放在大腸桿菌中表達(dá)，但是為了分泌表達(dá)（其實(shí)后來(lái)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pET系列分泌表達(dá)系列也不錯(cuò)）和糖基化修飾（主要是這個(gè)方面，因?yàn)槲业牡鞍资侨嗽吹模磉_(dá)出來(lái)用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長(zhǎng)，所以在做克隆的時(shí)候也要非常小心，需要注意的是：酶切位點(diǎn)不能出現(xiàn)在目的DNA片段中如果片段長(zhǎng)無(wú)法避免，可以采用平末端連接；雖然-factor可以自動(dòng)切除，但是在設(shè)計(jì)表達(dá)的時(shí)候，如果在N端不能出

7、現(xiàn)任何多余的aa（比如藥物蛋白表達(dá)），需要特別留意（說(shuō)明書(shū)上有詳細(xì)說(shuō)明：P13）；有三種不同的讀碼框（對(duì)于pPICZ系列來(lái)說(shuō)就是對(duì)上-factor序列），在設(shè)計(jì)克隆的時(shí)候要反復(fù)確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問(wèn)題；無(wú)論pPICZ還是pPICZ都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒(méi)有ATG（起始密碼子），有人認(rèn)為酵母啟動(dòng)子與外源基因的ATG之間的距離越短對(duì)于表達(dá)的該基因越有利；如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關(guān)基因表達(dá)偏好密碼子的問(wèn)題有人認(rèn)為沒(méi)有必要更換，有人認(rèn)為一定要換，個(gè)人認(rèn)為以產(chǎn)量為主要目的的可

8、以考慮更換基因密碼子，而如果片段過(guò)長(zhǎng)就比較麻煩，不過(guò)有許多真核保守蛋白其實(shí)是和酵母密碼子相似的；克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因?yàn)榕掠绊懙娇股刈饔茫╖eocin平板要避光保存）；測(cè)序引物可以用-factor信號(hào)引物，也可以用5'AOX1引物；如果需要高量表達(dá)，可以考慮做克隆的時(shí)候串聯(lián)基因片段進(jìn)行表達(dá)，另外也可以在轉(zhuǎn)化酵母的時(shí)候重復(fù)轉(zhuǎn)化。目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因?yàn)檫@個(gè)序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會(huì)影響

9、表達(dá)，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因?yàn)檫@些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會(huì)由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄，也需要多加注意。第二步就是將線性化的DNA轉(zhuǎn)化入Pichia酵母中。Xiang Yang：EasySelect試劑盒準(zhǔn)備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因?yàn)檫@個(gè)菌株轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量相對(duì)而言較高，如果你有電轉(zhuǎn)儀（electroporator），可以嘗試一下。如果沒(méi)有的話，EasySelect也準(zhǔn)

10、備了化學(xué)轉(zhuǎn)化試劑EasyComp Transformation，但是由于轉(zhuǎn)化率的緣故，我建議使用電轉(zhuǎn)儀。leslie：在得到了正確的序列之后就可以準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點(diǎn)有些不盡相同（Manual上寫(xiě)的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔(dān)心轉(zhuǎn)化率的話可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT表現(xiàn)型，也就是說(shuō)可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)，但是據(jù)說(shuō)會(huì)對(duì)外源基因表達(dá)有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成

11、二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護(hù)表達(dá)產(chǎn)物免受降解，促進(jìn)表達(dá)量的提高。     一般來(lái)說(shuō)，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用Mut細(xì)胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對(duì)較多(約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進(jìn)行。而對(duì)于分泌蛋白的表達(dá)，無(wú)論是甲醇利用慢 (Mut-)還是甲醇利用快(Mut+)的細(xì)胞都可應(yīng)用，如在人血清白蛋白(HSA)(為分泌型蛋白)的表達(dá)中就看不出兩種類(lèi)型的細(xì)胞之間有什么明顯差別。  &

12、#160; 所以一般手冊(cè)都會(huì)建議同時(shí)在這幾種菌株中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這主要是因?yàn)椴煌幕蛟诓煌慕湍妇锌赡鼙磉_(dá)量截然不同，因此在最開(kāi)始的時(shí)候建議多用幾種酵母菌實(shí)驗(yàn)。另外有個(gè)保存問(wèn)題，原始酵母菌一定要保存好，因?yàn)榻湍冈趥鞔啻魏髸?huì)影響其轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量，所以一方面分多管分裝保存于-80，另一方面如果出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化或者表達(dá)的問(wèn)題，在其它方面都沒(méi)有出錯(cuò)的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。    在準(zhǔn)備酵母菌的同時(shí)也需要準(zhǔn)備質(zhì)粒，由于酵母菌轉(zhuǎn)化對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的要求較高，量也較大（5-10ug），因此許多時(shí)候都會(huì)用PEG大提質(zhì)粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準(zhǔn)備好足夠量

13、的質(zhì)粒，并且不要忘記也要同時(shí)準(zhǔn)備空載體以做對(duì)照。在轉(zhuǎn)化前質(zhì)粒需要進(jìn)行線性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達(dá)量高的一個(gè)重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達(dá)）。線性化位點(diǎn)個(gè)人認(rèn)為也會(huì)影響到表達(dá)量，對(duì)于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個(gè)線性化位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機(jī)會(huì)少，而且也有可能遇上沒(méi)有合適的線性化位點(diǎn)的情況，這個(gè)時(shí)候也不是說(shuō)不能進(jìn)行表達(dá)，但是準(zhǔn)備的質(zhì)粒就要增加10倍，另外也可以進(jìn)行部分酶切（即先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，掐定時(shí)間和酶量保證被切開(kāi)的質(zhì)粒有部分是在線性化位點(diǎn)切開(kāi)而基因片段保存完好）。  

14、;  在線性化之后的質(zhì)粒就可以酒精沉淀回收了中間步驟需要使酶失活，說(shuō)明書(shū)建議是熱失活或者EDTA，個(gè)人認(rèn)為前者比較好，主要是擔(dān)心EDTA對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風(fēng)干，這一步需要多加注意保證風(fēng)干完全，因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)證明殘留的酒精對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響頗大。    接下來(lái)就是酵母轉(zhuǎn)化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實(shí)驗(yàn)決定表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)化方法有不少，例如電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，其方法的難易程度和轉(zhuǎn)化率高低呈反向遞減的，也就是說(shuō)電轉(zhuǎn)最容易，轉(zhuǎn)化率較高（但要求有電轉(zhuǎn)儀），而原生

15、質(zhì)體最麻煩，而且效果不好（比較傳統(tǒng)），因此不建議使用，EasySelect說(shuō)明書(shū)上這么建議，并且也詳細(xì)說(shuō)明了電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化（EasyComp和LiCl）方法的過(guò)程，可以按部就班。需要注意的是：（電轉(zhuǎn)過(guò)程）最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過(guò)的酵母放置時(shí)間不要超過(guò)一個(gè)星期；擴(kuò)大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，個(gè)人認(rèn)為不需要OD600達(dá)到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，這個(gè)時(shí)候的酵母比較新鮮，轉(zhuǎn)化率比較高；整個(gè)感受態(tài)制作過(guò)程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機(jī)，這是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵為了進(jìn)一步保證這一點(diǎn)，無(wú)菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉(zhuǎn)杯都要預(yù)冷；電轉(zhuǎn)儀需要預(yù)熱，所以準(zhǔn)備感受態(tài)的時(shí)候就可以

16、把電轉(zhuǎn)儀打開(kāi)了，電轉(zhuǎn)后山梨醇的加入要快，曾有人做實(shí)驗(yàn)證明晚一秒就會(huì)降低轉(zhuǎn)化的數(shù)量級(jí)，雖然不一定可信，但是我個(gè)人也認(rèn)為這個(gè)過(guò)程要快，電轉(zhuǎn)后可以看看時(shí)間，如果時(shí)間過(guò)短（比如4）就可能說(shuō)明雜質(zhì)較多，會(huì)影響轉(zhuǎn)化率；轉(zhuǎn)化后溫育是個(gè)增加同源重組，增加存活率的過(guò)程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30搖一段時(shí)間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉(zhuǎn)化率。如果沒(méi)有電轉(zhuǎn)儀，LiCl轉(zhuǎn)化是一種可供選擇的方法，轉(zhuǎn)化率是102到103cfu/ug。    主要過(guò)程為： 取過(guò)夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD

17、液體培養(yǎng)基，30培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8-1.0；4，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL ，4，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50l冰預(yù)冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至80-90ml。LiCl轉(zhuǎn)化 取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞12 000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入50%PEG         240ml1mmol/L LiCl   

18、36 ml單鏈鮭精DNA    25ml線性化質(zhì)粒DNA  10 ml (約10mg)用吸頭反復(fù)吹打，使細(xì)胞沉淀與加入的溶液混勻，30靜置溫育30min，42熱擊20-25min，4500rpm離心10min，吸棄轉(zhuǎn)化液，細(xì)胞沉淀加1ml YPD培養(yǎng)基于30 200 rpm培養(yǎng)2-4hr，取轉(zhuǎn)化混合液100ml涂布含100µg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30培養(yǎng)2-3天。第三步挑克隆篩選Xiang Yang：在protocol中用了許多篇幅來(lái)指導(dǎo)這一步，包括如何去通過(guò)平板篩選，觀測(cè)生長(zhǎng)速率來(lái)確定Mut表現(xiàn)型等。這個(gè)過(guò)程需要3到5天

19、，而我一般只用用了4個(gè)小時(shí)進(jìn)行PCR（AOX引物）篩選。leslie：完成轉(zhuǎn)化后就是克隆鑒定的過(guò)程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過(guò)程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因?yàn)楸容^快），具體過(guò)程protocol上說(shuō)的很清楚，其實(shí)也很簡(jiǎn)單，就是凍融破菌進(jìn)行菌落PCR，但是其中許多具體細(xì)節(jié)問(wèn)題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問(wèn)題，許多人用PCR方法進(jìn)行鑒定都無(wú)法得到結(jié)果，甚至在表達(dá)出了以后還是無(wú)法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無(wú)法正常釋放酵母基因組，一般通過(guò)培養(yǎng)菌然后進(jìn)行沸水和-20冷凍循環(huán)過(guò)程裂解細(xì)胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內(nèi)是可以得到好的結(jié)果的，但是有時(shí)候片段過(guò)長(zhǎng)，模壁就會(huì)阻礙擴(kuò)

20、增，所以我們實(shí)驗(yàn)室會(huì)用蝸牛酶（很便宜的酶來(lái)的）來(lái)幫助溶菌，我看許多實(shí)驗(yàn)室也會(huì)這么做，不過(guò)加入的時(shí)間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。    第二就是是模板量，個(gè)人建議模板真的不要加太多了，按照說(shuō)明書(shū)的上的5ul我覺(jué)得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當(dāng)然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來(lái)凍融的菌數(shù)量有關(guān)。其次是假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會(huì)出現(xiàn)3.6kb的片段，而Mut+則會(huì)出現(xiàn)AOX1基因原本長(zhǎng)度的片段大約長(zhǎng)2.2kb，因此如果的基因片段長(zhǎng)度相似，要注意區(qū)分。建議PCR過(guò)程中使用多

21、對(duì)引物進(jìn)行反應(yīng)，包括自己基因的，-factor的，5'AOX的，都可以，反正各種對(duì)照多了有利于比較當(dāng)然前提是你不能暈了頭。掉了毛的鴕鳥(niǎo)：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄終止子(5AOX1和3AOX1),他們被多克隆位點(diǎn)分開(kāi),外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標(biāo)記（HIS4區(qū)的整合方式為位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4）恢復(fù)野生型.HIS4區(qū)或AOX1區(qū)位點(diǎn)的整合都使轉(zhuǎn)化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進(jìn)行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而

22、具有HIS表型以篩選轉(zhuǎn)化子.）及3AOX1區(qū),當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí),他的5AOX1和3AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個(gè)載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,外源基因在5AOX1啟動(dòng)子的控制下表達(dá).在載體中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關(guān),通過(guò)篩選抗G418能力強(qiáng)的酵母即可獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性. 第四步表達(dá)Xiang Yang：將你的克隆在YP

23、D培養(yǎng)基中培育到OD600值達(dá)到6.0，就可以離心收菌。用表達(dá)培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30ºC培育過(guò)夜。leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說(shuō)什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達(dá)，有許多人在酵母表達(dá)上花費(fèi)了大量的時(shí)間不同于大腸桿菌的兩天出結(jié)果，一次畢赤酵母的表達(dá)就需要起碼一周的時(shí)間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場(chǎng)空，我個(gè)人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉(zhuǎn)化的酵母菌，另外調(diào)整進(jìn)行重新轉(zhuǎn)化。    另外剛開(kāi)始的時(shí)候可以用小量表達(dá)，可以用5ml：生長(zhǎng)慢型，生長(zhǎng)快型，陰性對(duì)照（空質(zhì)粒），陽(yáng)性對(duì)照（可以是曾經(jīng)表達(dá)成功的重組

24、子）和沒(méi)有進(jìn)行轉(zhuǎn)化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值2-6，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時(shí)間，一半為20-30分鐘，讓菌沉淀下來(lái)，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉(zhuǎn)入BMMY中誘導(dǎo)表達(dá)，這些步驟都需要在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行，如果要區(qū)分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表達(dá)，有可能會(huì)在沒(méi)有達(dá)到4天的時(shí)間培養(yǎng)基就干了，所以可以適當(dāng)補(bǔ)充一些，以及在搖床里放置盛有無(wú)菌水的深口瓶，來(lái)保持搖床里濕度。    誘導(dǎo)物甲醇注意要在超凈臺(tái)中打開(kāi)，可以分裝到滅過(guò)菌的瓶子中當(dāng)然甲醇是不能滅菌

25、的，而且也要注意在用酒精燈過(guò)甲醇瓶口的時(shí)候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。另外如果覺(jué)得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過(guò)紗布添加甲醇，這個(gè)方法可能會(huì)造成染菌，慎選。說(shuō)到紗布就想到了通氣性問(wèn)題，酵母在無(wú)氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導(dǎo)的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對(duì)于這一基因的表達(dá)影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專(zhuān)辟出一個(gè)搖床進(jìn)行三十度酵母表達(dá)，這樣可以考慮將紗布減少到35層，同時(shí)需要注意的是搖瓶?jī)?nèi)菌液體積不要超過(guò)10-30%。    每天取樣出來(lái)進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過(guò)每天做膠

26、跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時(shí)跑，不過(guò)樣品一定要煮過(guò)凍存，而且每次取樣不要反復(fù)凍融，最好分裝保存因?yàn)榈鞍捉?jīng)煮沸變性會(huì)不穩(wěn)定，容易降解。另外為了防止蛋白在分泌出來(lái)的過(guò)程就降解了（特別是小分子蛋白），也可以通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說(shuō)明書(shū)講解得詳細(xì)），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護(hù)物質(zhì)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白水解酶的活性來(lái)防止表達(dá)產(chǎn)物降解。    如果使用的是分泌型培養(yǎng)基，按道理收集培養(yǎng)基上清就可以進(jìn)行下一步分析了，但是由于培養(yǎng)基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測(cè)不出來(lái)的除非你的表達(dá)蛋白量非常大。所以需要進(jìn)行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉

27、淀，透析，超濾等等，當(dāng)然最簡(jiǎn)單的就是煮沸蒸發(fā)水分濃縮了。另外跑膠的時(shí)候同時(shí)對(duì)照酵母胞內(nèi)蛋白，以防沒(méi)有分泌出來(lái)。SDS-PAGE的配置參見(jiàn)分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對(duì)應(yīng)性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過(guò)是個(gè)需要全盤(pán)重新準(zhǔn)備的過(guò)程，要考慮清楚。如果選用的載體是帶有信號(hào)肽的，雖說(shuō)是分泌表達(dá)好純化，但實(shí)際上畢赤酵母本身還是有本底表達(dá)的，而且有時(shí)候會(huì)造成假陽(yáng)性，所以最后表達(dá)過(guò)程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細(xì)節(jié)可見(jiàn)Western Blotting前傳：想成為高手嗎？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒(méi)有合適抗體（如

28、果是利用從大腸表達(dá)出來(lái)的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統(tǒng)表達(dá)出來(lái)的蛋白無(wú)法發(fā)生免疫作用），可以選用anti-myc或者anti-his的，前提當(dāng)然是你的蛋白沒(méi)有提前終止。    其它在表達(dá)中可能出現(xiàn)的情況包括表達(dá)量低，沒(méi)有分泌表達(dá)（針對(duì)pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無(wú)法重復(fù)，表達(dá)出來(lái)的蛋白偏大等等，需要分各個(gè)方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號(hào)肽，但是就是無(wú)法分泌出來(lái)，這可能是蛋白結(jié)構(gòu)在通過(guò)細(xì)胞膜的時(shí)候受到了阻礙，可能需要重新轉(zhuǎn)化，更換線性化位點(diǎn)或者更換菌株；如果蛋白表達(dá)第一天較高，但是之后越來(lái)越少，這很有可能是蛋白降解了或者產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)；畢赤酵母無(wú)法

29、重復(fù)的問(wèn)題比較嚴(yán)重，許多情況下在第一次獲得了高量表達(dá)之后就再怎么也重復(fù)不了這個(gè)結(jié)果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達(dá)出來(lái)的蛋白分子量偏大則是個(gè)正?，F(xiàn)象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進(jìn)行WB或進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。第五步發(fā)酵和產(chǎn)物純化Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE Healthcare），經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一個(gè)大小為45kDa，可以通過(guò)二硫鍵形成反向平行二聚體（antiparallel homodimer）的糖蛋白，經(jīng)過(guò)純化，我通過(guò)一個(gè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（cell prol

30、iferation assay）檢測(cè)了其活性，結(jié)果表明表達(dá)出來(lái)的蛋白在體外有完全的活性。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結(jié)合活性，與對(duì)照（通過(guò)大腸桿菌和Bacular細(xì)胞未帶tag的蛋白）相比，his-tag有一點(diǎn)副作用。伊可麗：由于在搖瓶培養(yǎng)中巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的水平往往不能準(zhǔn)確地反映罐發(fā)酵中的表達(dá)情況，使之成為令人頭痛的問(wèn)題。主要原因是在搖瓶培養(yǎng)中，培養(yǎng)液的pH值無(wú)法控制，培養(yǎng)物通氣不充分及無(wú)法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對(duì)每一個(gè)表達(dá)菌株進(jìn)行繁瑣的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)，仍需摸索表達(dá)菌株的搖瓶培養(yǎng)條件，使其產(chǎn)物的表達(dá)量與預(yù)期的發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果相近。  

31、60; 總而言之，EasySelect系統(tǒng)是一個(gè)便于操作的酵母表達(dá)系統(tǒng)，我已經(jīng)使用這一系統(tǒng)表達(dá)過(guò)15個(gè)類(lèi)似物了，每一個(gè)我都獲得了超過(guò)1mg/1升培養(yǎng)液的純化蛋白。（生物通：亞歷）.2 巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的降解機(jī)理及其控制策略 1.2.1 巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的降解機(jī)理 在 外源蛋白的表達(dá)過(guò)程中，宿主菌畢赤酵母的胞內(nèi)和胞外均有一定量的蛋白酶的表達(dá)，因此，不論是胞內(nèi)表達(dá)亦或是分泌表達(dá)，大多數(shù)外源蛋白均面臨著被降解的問(wèn) 題，這也是影響表達(dá)量的一個(gè)重要因素，同時(shí)，還增加了純化目的蛋白的難度。近年來(lái)，蛋白酶的研究是P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)一個(gè)重點(diǎn)和熱點(diǎn)。越來(lái)越多 的蛋白酶的遺傳背景和生

32、理生化性質(zhì)得到深入的研究52; 53。P.pastoris能根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境（碳源的改變以及細(xì)胞或細(xì)胞器的脅迫）來(lái)調(diào)整自身酶系，以合成與降解不同的蛋白和細(xì)胞器，液泡是蛋白質(zhì)降 解最主要的場(chǎng)所54，另一降解場(chǎng)所是細(xì)胞基質(zhì)蛋白酶體中。但是，對(duì)于外源蛋白來(lái)說(shuō)，其降解常在表達(dá)和分離純化的第一步，主要是由培養(yǎng)基中胞外蛋白酶， 細(xì)胞外膜結(jié)合蛋白酶（cell-bound proteases）55和細(xì)胞自噬或裂解釋放的胞內(nèi)蛋白酶降解的5。胞內(nèi)蛋白酶主要涉及降解蛋白質(zhì)前體產(chǎn)生活性蛋白；切除轉(zhuǎn)運(yùn)出膜后的蛋白質(zhì)信 號(hào)肽；使調(diào)控蛋白失活；降解變異或不需要的蛋白質(zhì)；提供營(yíng)養(yǎng)，前體和能量。胞外蛋白酶分泌較少，主要降解部分

33、蛋白質(zhì)提供氨基酸和多肽等營(yíng)養(yǎng)22。 根 據(jù)蛋白酶的分泌和作用地點(diǎn)，P.pastoris的胞內(nèi)蛋白酶可以分為三種類(lèi)別，即液泡蛋白酶（vacuolar proteases），細(xì)胞基質(zhì)蛋白酶體（the cytosolic proteosome）以及分泌途徑的蛋白酶（proteases located along the secretory pathway）52; 56。 表1.2畢赤酵母液泡蛋白酶和分泌途徑蛋白酶57 Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory pathway57 Enzyme Type Gene Zymo

34、gen form Vacuole PrA Aspartic PEP4 Yes PrB Serine PRB1 Yes CpY Serine PRC1 Yes CpS Metallo-( Zn2+) CPS1 Unknown ApI Metallo-( Zn2+) LAP4 Yes ApCo Metallo-(Co2+) DAP2 No DPAP-B Serine SEC11 Unknown Secretory pathway signal peptidase Kex2 protease Serine KEX2 Yes Kex1 carboxypeptidase Serine KEX1 No D

35、PAP-A Serine STE13 Unknown,predict no Yeast aspartyl protease Aspartic YAP3 Unknown,predict yes 巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的降解機(jī)理及其控制策略酵母液泡位于基質(zhì)中，一方面是維持胞內(nèi)pH和鹽離子平衡，儲(chǔ)藏鹽離子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特異性的水解酶，較寬底物范圍的內(nèi)生和異源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至細(xì)胞器的一個(gè)重要場(chǎng)所，大約80的蛋白在液泡中降解57。 在P.pastoris生長(zhǎng)和表達(dá)外源蛋白過(guò)程中，由于碳源從葡萄糖或甘油到甲醇的改變，甲醇代謝酶系 （AOX,FAD,DHAS等）和過(guò)氧

36、化氫體逐步積累，同時(shí)，相應(yīng)的蛋白酶也產(chǎn)生了。由于細(xì)胞器脅迫的影響，過(guò)氧化氫體一部分在基質(zhì)中自噬降解，大部分過(guò) 氧化氫體轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中得到降解58。 P.pastoris 中位于與細(xì)胞膜結(jié)合的胞內(nèi)蛋白酶類(lèi)可分為蛋白質(zhì)水解酶（內(nèi)切酶）和多肽外切酶，由蛋白酶，羧肽酶，氨肽酶類(lèi)組成53。所有的蛋白酶都是由其蛋白酶前體 經(jīng)過(guò)酶切活化而成，按照其作用活性位點(diǎn)又分為4類(lèi)，絲氨酸類(lèi)蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸類(lèi)蛋白酶和天冬氨酸類(lèi)蛋白酶。絲氨酸類(lèi)蛋白酶最適pH值比較高， 又叫堿性蛋白酶，而天冬氨酸類(lèi)蛋白酶需要低的pH范圍，又叫酸性蛋白酶22。主要的液泡內(nèi)蛋白酶有以下幾種：蛋白酶 A（proteinaseA，PrA

37、），蛋白酶B（proteinase B，PrB），羧肽酶Y（carboxypeptidases Y，CpY），羧肽酶S（carboxypeptidases S，CpS），氨肽酶I （aminopeptidases I，ApI），氨肽酶Co（aminopeptidase Co，ApCo）， 二肽氨肽酶B（Dipeptidyl aminopeptidase B，DPAP-B）。蛋白酶A，分子量約42kDa，是天冬氨酸類(lèi)蛋白酶，由基因PEP4表達(dá)59，其前體能自身催化而形成成熟的蛋白酶，并催化羧肽 酶Y前體和蛋白酶B前體形成羧肽酶Y和蛋白酶B；蛋白酶B，分子量約32kDa，絲氨酸類(lèi)蛋白酶，由基因PR

38、B1表達(dá)60，對(duì)基因PRB1克隆和測(cè)序 發(fā)現(xiàn)是一個(gè)很大閱讀框，編碼一個(gè)最少69 kDa的前提60，其前體有50的自身催化成蛋白酶B，另一部分由蛋白酶A催化；蛋白酶A和蛋白酶B是液泡中最基本的蛋白酶，是其他蛋白質(zhì)水解酶的 激活劑。羧肽酶Y，是絲氨酸類(lèi)蛋白酶，由基因 PRCl編碼, 其生物合成，液泡內(nèi)分揀和CPY的加工成熟目前研究很清楚61-63。PRCl基因編碼的羧肽酶Y前體包含一個(gè)N-端信號(hào)肽，一個(gè)含90個(gè)氨基酸的前 肽和一個(gè)含421個(gè)氨基酸的酶活區(qū)域64。羧肽酶Y前體經(jīng)過(guò)高爾基體后切除糖鏈得到一個(gè)69kDa的中間體，然后在液泡中切除前肽形成61 kDa成熟的羧肽酶Y。羧肽酶Y前體（67kDa

39、）沒(méi)有生物活性，必須在蛋白酶B作用下或蛋白酶A與蛋白酶B共同作用才能形成成熟的羧肽酶Y。羧肽酶S， 是一個(gè)由基因CPSI編碼，依賴(lài)于金屬離子的羧肽酶，分子量7377kDa56.，其合成與膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)。 氨肽酶I，由基因LAP4編碼，是一個(gè)含有12個(gè)亞基分子量為640 kDa的金屬多肽65，氨肽酶Co是一個(gè)分子量為100kDa 的Co2+金屬多肽66,其機(jī)理目前不清楚。二肽氨肽酶B，由基因DAP2 編碼的膜接合液泡蛋白酶，在傳遞到液泡前沒(méi)有蛋白酶活性56; 67。 酵母液泡中的各種蛋白酶量會(huì)隨著 發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)條件的改變發(fā)生變化，如發(fā)酵過(guò)程中的饑餓脅迫、碳源改變、熱和pH變化及有毒有害產(chǎn)物的形

40、成等。分泌到胞外的重組蛋白降解有可能是由于蛋白 酶的過(guò)表達(dá)而部分分泌到胞外所致和高密度培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞自溶造成膜破裂而釋放出蛋白酶兩種因素引起。在Sinha的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)P. pastoris從甘油生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)為以甲醇為碳源誘導(dǎo)表達(dá)階段時(shí)，培養(yǎng)基中的各種蛋白酶量明顯增加，遠(yuǎn)高于一直以甘油作為碳源的實(shí)驗(yàn)對(duì)照組68。 基質(zhì)蛋白酶體，又稱(chēng)蛋白體，多蛋白酶復(fù)合體，多催化功能蛋白酶，存在于真核細(xì)胞內(nèi)，主要完成蛋白酶水解途徑的中間過(guò)程，其中 20S的蛋白酶體，位于所有真核生物的細(xì)胞核和細(xì)胞間質(zhì)中，是一個(gè)分子量為700 kDa 圓柱形顆粒，由14個(gè)不同的亞基折疊纏繞而成。26S蛋白酶體是一個(gè)巨型蛋白酶復(fù)合物，分子量

41、高達(dá)1700 kDa，主要降解依賴(lài) ATP的泛醌類(lèi)蛋白質(zhì)，它是由2個(gè)19S 蛋白酶體連接到20S 蛋白酶體兩端構(gòu)成69，它們主要負(fù)責(zé)短周期的蛋白質(zhì)的分揀和快速降解，包括某些對(duì)細(xì)胞有害的蛋白質(zhì)。液泡和蛋白酶體降解的互作是調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程的一個(gè)重 要方式，特別是對(duì)細(xì)胞脅迫的響應(yīng)方面53; 70。 分泌途徑的蛋白酶主要分布在高爾基體和細(xì)胞質(zhì)膜上，其功能是去處去除蛋白酶前體上的多肽52，主要的蛋白酶有信號(hào)肽 （Signal peptidase），Kex2蛋白酶（Kex2 Endoproteas ），Kexl 羧肽酶（Kexl carboxypeptidase）二肽氨肽酶A（ Dipeptidyl Amin

42、opeptidase A， DPAP-A），酵母天冬酰胺蛋白酶III （Yeast Aspartyl Protease III，Yap3 Protease)。信號(hào)肽是一個(gè)最少包含4個(gè)亞基的完整的膜蛋白56。Kex2蛋白酶，由基因KEX2編碼，其功能是切除COOH-端的Lys- Arg or Arg-Arg 鍵殘基 71。Kexl 羧肽酶，由基因KEXl 編碼，是一個(gè)特異性的絲氨酸類(lèi)蛋白酶，二肽氨肽酶A，由基因STE13編碼的膜蛋白，酵母天冬酰胺蛋白酶III，其功能是在Kex2蛋白酶的作用下，切除 受體COOH-端因子前體72。 在 發(fā)酵過(guò)程中，由于高密度細(xì)胞的影響以及部分細(xì)胞的裂解，液泡中的蛋

43、白酶常釋放到培養(yǎng)基中，導(dǎo)致目的蛋白的降解。在發(fā)酵的過(guò)程中，隨著外源蛋白在培養(yǎng)基中的 濃度不斷提高，蛋白水解酶濃度也隨著升高，對(duì)外源蛋白產(chǎn)生降解作用。因此，防止蛋白水解酶的水解作用，提高外源蛋白的穩(wěn)定性，減少外源蛋白的損失，也就相 對(duì)地提高了外源蛋白的產(chǎn)量。 1.2.2 巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的降解控制策略 蛋白酶降解是酵母表達(dá)系統(tǒng)的共有一個(gè)缺陷，降解不僅能引起目的蛋白的產(chǎn)率下降，降解形成的片斷還能造成分離純化極大困難，特 別是與目的蛋白分子量大小相差很小的降解產(chǎn)物，由于它們的理化性質(zhì)接近，常規(guī)的分離方法很難將它們分離開(kāi)來(lái)，導(dǎo)致產(chǎn)品收率大大下降，產(chǎn)品純度低，蛋白的比 活性降低。幾乎所有在酵母

44、中表達(dá)的重組蛋白都或多或少地存在表達(dá)蛋白降解問(wèn)題，只是程度不同而已。而表達(dá)蛋白發(fā)生降解的不同程度往往是由于發(fā)酵培養(yǎng)條件和 發(fā)酵控制方式不同所致。盡管降解程度有所不同，但引起蛋白降解的直接原因是酵母細(xì)胞自身存在的各種蛋白酶。 蛋 白質(zhì)的降解常引起目的蛋白產(chǎn)率的減少，生物活性的降低，并在分離純化過(guò)程中降解產(chǎn)物由于類(lèi)似的物化或親和性質(zhì)而造成產(chǎn)物污染5。P. pastoris表達(dá)外源蛋白時(shí)的蛋白降解控制策略日益受到重視。為避免蛋白酶的降解，不同的策略得到應(yīng)用，如2使用蛋白酶缺陷菌株（protease deficient strains）, 對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾（modification of the

45、protein structure）, 添加蛋白酶抑制劑（addition of protease inhibitors）,改變培養(yǎng)基pH（ changing the pH of the culture medium）以及添加在培養(yǎng)基中補(bǔ)加，如酪蛋白水解物（Casamino acids）、蛋白胨（yeast peptone）等一些富含氨基酸和多肽的組分。歸納起來(lái)可以分為三種水平策略：培養(yǎng)水平(cultivation-level strategies)，細(xì)胞水平( cellular-level strategies )和蛋白質(zhì)水平策略(protein-level strategies)5。 1.

46、2.2.1 培養(yǎng)水平策略 提 高分泌蛋白的穩(wěn)定性可通過(guò)改變培養(yǎng)基的pH來(lái)加以改善。P. pastoris的pH適應(yīng)范圍比較廣，可以在pH 2.87的范圍內(nèi)生長(zhǎng)。不同的蛋白酶有不同的最佳pH作用范圍，選擇適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵pH可以不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，但可降低蛋白酶活性，減少目的蛋白的降解。 P. pastoris在pH 3.0條件下發(fā)酵重組水蛭素比pH 5.0下的降解少73。pH 6.0 最適人表皮生長(zhǎng)因子20和白蛋白74的表達(dá)，在pH 3.0 最適人胰島素樣生長(zhǎng)因子、CD4蛋白的V1亞基表達(dá)，而咖啡豆半乳糖苷酶在pH45不降解，pH高或低均降解，pH 3.0最嚴(yán)重5; 20; 75。 低溫能影響目的蛋白

47、的產(chǎn)量，主要是由于溫度較高時(shí)，重組蛋白不穩(wěn)定，以及死細(xì)胞釋放的蛋白酶的活性增強(qiáng)76。Li 等77實(shí)驗(yàn)說(shuō)明將培養(yǎng)溫度從30降低到23時(shí),畢赤酵母表達(dá)鯡魚(yú)抗凍蛋白從5.3mg/L上升到18.0mg/L, 同時(shí)也發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞率（cell viability）增加。Hong et al.通過(guò)降低發(fā)酵溫度(從30降到 20)使表達(dá)的laccase活性增強(qiáng)78。Jahic et al.79應(yīng)用溫度限制流加發(fā)酵技術(shù)（a temperature-limited fed-batch technique，TLFB)獲得了更高濃度的融合蛋白，同時(shí)細(xì)胞死亡率和蛋白酶活性都降低。 通 過(guò)添加特異性蛋白酶抑制劑也可減少目的蛋白的降解80。Shi et al 81利用畢赤酵母表達(dá)抗Mamestra configurata serpin單鏈抗體(scFv)時(shí)候，鑒定到存在三種蛋白酶類(lèi)，即天冬氨酸型蛋白酶、半胱氨酸型蛋白酶及絲氨酸型蛋白酶。通