腫瘤抗原沖擊致敏的IL-2基因修飾的巨噬細胞治療腎癌的實驗研究

1、腫瘤抗原沖擊致敏的IL-2基因修飾的巨噬細胞治療腎癌的實驗研究邱實曹雪濤弭靜袁正隆雷虹張明徽朱學軍閔志廉 摘要目的：觀察體外腫瘤抗原沖擊致敏的白細胞介素2（IL-2）基因修飾的巨噬細胞對腎癌小鼠的治療效果并探討其相關的免疫機理。方法：通過重組腺病毒的介導，將IL-2基因轉入新鮮分離的小鼠腹腔巨噬細胞，經(jīng)腫瘤抗原沖擊致敏后回輸治療原位腎癌小鼠，采用4 h 51Cr釋放法檢測脾臟NK和CTL活性。結果：IL-2基因修飾的巨噬細胞經(jīng)腫瘤抗原沖擊后體內(nèi)回輸可使腎癌小鼠肺轉移結節(jié)明顯減少，存活期明顯延長，40%腎癌小鼠達到長期存活。治療后荷瘤小鼠脾臟NK和CTL活性顯著提高。結論：IL-2基因修飾的巨噬

2、細胞經(jīng)腫瘤抗原沖擊后自體回輸是治療腎癌的有效方法。 關鍵詞腎細胞癌巨噬細胞白細胞介素2基因治療免疫治療 中國圖書分類號R392.11R737.11 Therapy of renal cancer with tumor antigen-pulsed， IL-2 gene-modified macrophages QIU Shi， CAO Xue-Tao， MI Jing et al. Department of Urology， Changzheng Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200003 AbstractObj

3、ective: To investigate the treatment for renal cancer (Renca)-bearing mice with tumor antigen-pulsed， IL-2 gene-modified macrophages and their related immunological mechanism. Methods: Renca-bearing mice were infused with tumor antigen-pulsed， IL-2 gene-modified macrophages. The CTL and NK activitie

4、s were detected by 4 h 51Cr release assay. Results: Macrophages could be activated by auto-secreted IL-2 after IL-2 gene modification. If IL-2 gene-modified macrophages were pulsed with tumor antigen in vitro and then infused into Renca-bearing mice， pulmonary metastases of Renca-bearing mice were r

5、educed，survival time prolonged apparently and 40% of mice were tumor free. After treatment， NK，CTL activities increased significantly. Conclusion: Infusion of IL-2 gene-modified、tumor antigen-pulsed macrophages might be an effective therapy for renal cancer. Key words Renal cancerMacrophageInterleuk

6、in-2Gene therapyImmunotherapy 腎癌對放、化療均不敏感，臨床上對原發(fā)孤立性腎癌均采用根治性腎癌切除術，一旦腎癌淋巴結轉移，即使行根治性淋巴結清掃術，患者生存期極少超過5年，如果出現(xiàn)腎癌肝、肺轉移或鄰近臟器浸潤，則預后更差。巨噬細胞（Macrophage，M）過繼回輸治療腫瘤已應用于臨床十余年，但療效不理想，這是由于回輸?shù)木奘杉毎坏┦ネ饨绲拇碳?，難以維持活化狀態(tài)。作為一種新興治療方法，基因療法為治療腎癌提供了新的研究方向。我們將IL-2基因轉入新鮮分離的巨噬細胞，初步證實IL-2基因修飾的巨噬細胞可持續(xù)穩(wěn)定地分泌IL-2，增強了巨噬細胞殺傷活性和抗原提呈能力1，2

7、。在此基礎上，我們用IL-2基因修飾的抗原沖擊致敏的巨噬細胞過繼回輸治療腎癌小鼠，并分析了相關的免疫機理。 1材料與方法 1.1材料 1.1.1動物與細胞株BALB/C小鼠，68周齡，雄性，由上海必凱實驗動物有限公司提供；BALB/C小鼠腎細胞癌細胞（Renca）由美國國立癌癥研究所Wiltroult博士饋贈；重組腺病毒包裝細胞293細胞（人胚腎細胞）由德國MDC分子醫(yī)學中心Blankenstein教授惠贈；Yac-1細胞由本室傳代培養(yǎng)。 1.1.2主要試劑攜帶小鼠IL-2基因的重組腺病毒載體Adex1 CA mIL-2 (簡稱Ad-mIL-2)、攜帶LacZ對照基因的重組腺病毒載體Adex1

8、 CA-RxZ(簡稱Ad-LacZ)由日本癌癥研究會分子生物治療研究部Hirofumi Hamada博士惠贈；放射線同位素Na251CrO4購自Amersham公司。 1.2方法 1.2.1腫瘤抗原的制備參見文獻3。收集對數(shù)生長期的Renca細胞，用RPMI-1640配成1108 ml-1，反復凍融45次，離心(5 000 r/min30 min)收集上清，過濾除菌后用作腫瘤抗原(簡稱Ag)。大量制備同一批該腫瘤細胞凍融物，作為Ag供體內(nèi)外實驗使用，避免差異。 1.2.2小鼠腹腔巨噬細胞的制備、IL-2基因修飾及抗原致敏常規(guī)提取腹腔細胞，孵箱培養(yǎng)2 h后洗去懸浮細胞，可獲得較純的貼壁巨噬細胞。

9、12mmol/L 利多卡因在37條件下消化巨噬細胞。按本室常規(guī)方法4，將IL-2基因轉染至新鮮分離的巨噬細胞，MOI值為50，同時設立LacZ基因病毒對照和未經(jīng)基因修飾的細胞對照。IL-2基因修飾后24 h巨噬細胞懸液中再加入制備的腫瘤抗原（MAg為15），作用4 h后，收集巨噬細胞，配成1107 ml-1待用。 1.2.3腎癌小鼠模型的建立和治療將對數(shù)生長期Renca細胞用RPMI-1640配成1106 ml-1，取0.1 ml腎癌細胞于小鼠腎包膜下接種（1105/只），小鼠荷瘤3 d后隨機分組并開始治療。每只小鼠腹腔、尾靜脈內(nèi)各注射已配好的巨噬細胞懸液0.1 ml（2106 M/只）。每3

10、 d治療1次，連續(xù)4次。觀察小鼠存活期，每組10只；4 w后(包括4 w內(nèi)死亡小鼠)計數(shù)肺表面轉移結節(jié)數(shù)目，每組8只。 體內(nèi)實驗分組如下：A組：未治組；B組：RPMI-1640對照組(RPMI-1640)；C組：未處理的M組(M)；D組：未處理的M+Ag組(M+Ag)；E組：對照基因(LacZ)修飾的M組(LacZ-M)；F組：對照基因(LacZ)修飾的M+Ag組(LacZ-M+Ag)；G組：IL-2基因修飾的M組(IL-2-M)；H組：IL-2基因修飾的M+Ag組(IL-2-M+Ag)。 1.2.4小鼠脾細胞CTL活性誘導Renca細胞經(jīng)30Gy 60Co照射滅活，用于體外CTL活性的誘導。

11、無菌取小鼠脾臟，研磨過200目鋼網(wǎng)制成單細胞懸液，用Tris-NH4Cl溶破紅細胞，洗3次，制成淋巴細胞懸液，直接進行NK活性測定，部分細胞用完全培養(yǎng)基調濃度為5106 ml-1，將其與滅活的Renca細胞以201的比例置于含IL-2 100 U/ml、10%FCS的RPMI-1640中培養(yǎng)，3 d后半量換液，7 d后檢測CTL活性。 1.2.5小鼠脾細胞NK活性及經(jīng)誘導的CTL殺傷活性的檢測取第4次治療后3 d荷瘤小鼠脾細胞檢測NK及誘導的CTL活性，均采用4 h 51Cr釋放法。檢測NK活性時選用YAC-1細胞為靶細胞；檢測CTL活性時以Renca細胞作為靶細胞，以CT26小鼠結腸腺癌細胞

12、作為對照靶細胞。效靶比為1001， 實驗中自然釋放率均低于15%。 1.2.6統(tǒng)計學處理采用未配對計量資料的t檢驗。 2結果 2.1治療后荷瘤小鼠肺表面轉移結節(jié)數(shù)M組和LacZ-M組及相應的腫瘤抗原沖擊組（M+Ag組、LacZ-M+Ag組）的荷瘤小鼠肺表面轉移結節(jié)數(shù)與未治療組、RPMI-1640組相比有明顯下降（P0.05），而M組、LacZ-M組、M+Ag組和LacZ-M+Ag組之間無明顯差異；單純IL-2基因修飾的巨噬細胞治療組(IL-2-M組)的小鼠肺轉移結節(jié)數(shù)又比未治療組、RPMI-1640組明顯減少(P0.01)，如果該巨噬細胞體外再經(jīng)腫瘤抗原沖擊致敏后回輸(IL-2-M+Ag組)，

13、則小鼠肺轉移結節(jié)數(shù)進一步明顯減少(P0.001，見圖1)。 2.2治療后荷瘤小鼠存活期IL-2-M組的荷瘤小鼠存活期明顯延長，10%小鼠達到長期存活（超過3個月）；如果再經(jīng)體外抗原沖擊后回輸治療，小鼠長期存活率達到40%。未治療組、RPMI-1640組小鼠分別在3032 d全部死亡； M組、LacZ-M組和M+Ag組、LacZ-M+Ag組僅能延長小鼠存活期，最長達52 d，無小鼠長期存活。腎癌小鼠死后解剖多見血性胸、腹水，肺部可見大小不等的結節(jié)性腫瘤轉移灶，腹腔也可見種植性腫瘤結節(jié)(見圖2)。 圖1IL-2基因修飾的巨噬細胞治療后腎癌小鼠肺轉移結節(jié)數(shù)的變化 Fig.1The number of

14、 pulmonary metastatic node in renal cancer-bearing mice after treatment with IL-2 gene-modified macrophages Note:A:No treatment group；B：RPMI-1640 group；C：M group；D：M+Ag group；E：LacZ-M group；F：LacZ-M+Ag group；G：IL-2-M group；H：IL-2-M+Ag group 2.3荷瘤小鼠NK活性的變化未治療組、RPMI-1640組、M組和LacZ-M組的小鼠NK活性較低，M組和LacZ-M

15、組雖經(jīng)腫瘤抗原沖擊也不能引起NK活性顯著增強；而IL-2-M組NK活性顯著增強（P0.05），IL-2-M+Ag組的NK活性進一步增強（與IL-2-M組比P0.05；與其他各組比P0.05）；而IL-2-M+Ag組的CTL活性不僅比其他各組顯著增強（P0.01），較IL-2-M組也有明顯增強（P0.05），說明腫瘤抗原沖擊致敏的IL-2基因修飾的M可提高機體的特異性免疫功能；各組CTL對CT26的殺傷活性均很低，且無明顯差異，說明該CTL為Renca特異性。另外，與M組比，LacZ-M組的NK和CTL活性無明顯變化，表明腺病毒的修飾對M的功能無明顯影響(見圖4)。 圖2IL-2基因修飾的巨噬細

16、胞治療后腎癌小鼠的存活期 Fig.2Survival time of renal cancer-bearing mice after treatment with IL-2 gene-modified macrophages 圖3IL-2基因修飾的巨噬細胞治療后荷瘤小鼠脾臟NK活性 Fig.3The NK activity of splenocytes from tumor-bearing mice after treatment with IL-2 gene-modified macrophages Note:A:No treatment group；B：RPMI-1640 group；C：

17、M group；D：M+Ag group；E：LacZ-M group；F：LacZ-M+Ag group；G：IL-2-M group；H：IL-2-M+Ag group 圖4IL-2基因修飾的巨噬細胞治療后荷瘤小鼠脾臟CTL活性 Fig.4The CTL activity of splenocytes from tumor-bearing mice after treatment with IL-2 gene-modified macrophages Note:A:No treatment group；B：RPMI-1640 group；C：M group；D：M+Ag group；E：L

18、acZ-M group；F：LacZ-M+Ag group；G：IL-2-M group；H：IL-2-M+Ag group 3討論 既往認為IL-2受體（IL-2R）僅存在于淋巴細胞表面，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)它還存在于單核/巨噬細胞表面。未被激活的巨噬細胞并不合成IL-2R mRNA，而IL-2可促使巨噬細胞合成IL-2R mRNA，大量表達mIL-2R蛋白，同時IL-2誘導巨噬細胞分泌TNF、IL-1、NO，增強其細胞毒作用，因此IL-2對巨噬細胞的激活作用引起人們的關注5，6。IL-2被美國食物和藥品管理局唯一認可用于臨床免疫治療腎癌的細胞因子，能激活巨噬細胞，誘導T淋巴細胞增殖、分化，但因全身應

19、用劑量大，副作用較多，體內(nèi)半衰期短，臨床上常選用IL-2活化的效應細胞過繼免疫，如LAK/IL-2、TIL/IL-2。由于腫瘤細胞，特別是轉移性腫瘤細胞異質性，使特異性殺傷細胞回輸療法不能有效地清除機體腫瘤，而巨噬細胞殺傷腫瘤作用不受腫瘤細胞異質性的限制。近年來，在體外活化的巨噬細胞過繼回輸治療腫瘤，特別是轉移性腫瘤方面，國外學者開展了大量的動物實驗和臨床研究，并取得了較為理想的抗腫瘤效果7，8。過繼免疫治療實驗研究多采用異位荷瘤（如皮下）或實驗性腫瘤轉移動物模型，實驗結果與臨床應用往往有很大差別；我們采用小鼠原位腎癌模型，其發(fā)病過程與腎細胞癌患者的臨床過程相似，因此，動物實驗結果能更好地指導

20、臨床治療。 本研究結果表明，與未治療組和RPMI-1640組相比，巨噬細胞或對照基因修飾的巨噬細胞經(jīng)或未經(jīng)腫瘤抗原沖擊后回輸治療，肺轉移結節(jié)明顯減少，小鼠存活期延長，但無小鼠長期存活；單純IL-2基因修飾的巨噬細胞回輸治療效果較明確（肺轉移結節(jié)進一步明顯減少，10小鼠長期存活）；如果再行腫瘤抗原沖擊致敏，則治療效果又能進一步提高（肺轉移結節(jié)又進一步明顯減少，40小鼠長期存活），治療效果與NK和CTL活性正相關。同時，我們也發(fā)現(xiàn)，IL-2-M+Ag組的CTL活性比IL-2-M組明顯提高，而M+Ag組和LacZ-M+Ag組的CTL活性較M組和LacZ-M組雖有所增強，但不明顯，且治療后小鼠存活期和

21、肺轉移結節(jié)數(shù)無明顯差異。最近，有些實驗顯示巨噬細胞與腫瘤抗原接觸后抗原提呈能力提高，殺瘤活性增強。體外吞噬凋亡小體的巨噬細胞表面分子MHC-I、MHC-II、B7-1、B7-2和ICAM-1表達增加，抗原提呈能力提高，如果再加入少量的IL-2，則抗原提呈能力顯著提高8；巨噬細胞經(jīng)CTL MAGE-3.A2多肽體外沖擊4 h后可引起CTL MAGE-3.A2細胞克隆活性顯著增強，增強幅度與抗原沖擊量呈正相關，但抗原沖擊后巨噬細胞隨著時間延長，對CTL活化功能迅速下降，每24 h下降70%80%9。我們認為，IL-2基因修飾的巨噬細胞能持續(xù)穩(wěn)定地分泌IL-2，保持巨噬細胞的活化功能，協(xié)同并延長腫瘤

22、抗原沖擊對巨噬細胞抗原提呈能力的提高作用；巨噬細胞單純行腫瘤抗原沖擊，抗原提呈功能增強，甚至處于活化狀態(tài)，但難以長時間維持，隨著時間延長而迅速下降，誘導的CTL活性也迅速下降。所以，巨噬細胞是否處于和保持活化狀態(tài)，對腫瘤抗原沖擊致敏的巨噬細胞功能影響較大10。IL-2基因修飾的巨噬細胞誘導機體非特異性殺傷功能增強，表現(xiàn)在NK活性提高，這與IL-2關系密切，已證實IL-2可直接誘導NK活性11，而腫瘤抗原沖擊可增強IL-2的作用。NK在抗腫瘤過程中也發(fā)揮著積極的作用，anti-CD122單抗去除NK細胞，可明顯降低IL-2基因修飾的神經(jīng)母細胞瘤的抗腫瘤作用12。 總之，腫瘤抗原沖擊致敏的IL-2

23、基因修飾的巨噬細胞回輸療法是治療腎癌的一種有效方法，回輸體內(nèi)的巨噬細胞不僅可以直接發(fā)揮其非特異性腫瘤殺傷功能，而且可通過抗原提呈作用，激活機體特異性免疫力，進一步增強抗腫瘤作用。該方法以小鼠原位腎癌為模型進行治療，取得了良好的療效，為臨床治療腎癌提供了新的思路。 (編輯許四平) 本課題受上海市優(yōu)秀學科帶頭人計劃資助(97XD1406) 作者簡介：邱實，男，33歲，博士，主要從事腫瘤免疫的研究； 閔志廉，男，58歲，博士生導師，主要從事普通泌尿和移植免疫的研究 邱實（第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院泌尿外科，上海 200003） 曹雪濤（第二軍醫(yī)大學免疫學教研室，上海200433） 弭靜（第二軍醫(yī)大學免疫學

24、教研室，上海200433） 袁正隆（第二軍醫(yī)大學免疫學教研室，上海200433） 雷虹（第二軍醫(yī)大學免疫學教研室，上海200433） 張明徽（第二軍醫(yī)大學免疫學教研室，上海200433） 朱學軍（第二軍醫(yī)大學免疫學教研室，上海200433） 閔志廉（第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院泌尿外科，上海 200003） 4參考文獻 1邱實，曹雪濤，張明徽 et al. IL-2基因修飾對巨噬細胞表型和抗原提呈功能的影響. 中國免疫學雜志，1999；15(11)：484 2邱實，閔志廉，雷虹 et al. IL-2基因修飾對巨噬細胞殺瘤活性的影響. 第二軍醫(yī)大學學報， 2000；21(1)：24 3Grabbs S

25、， Bruvers S， Beissert S et al. Interferon- inhibits tumor antigen presentation by epidermal antigen-presenting cells. J Leuko Cyte Biol， 1994； 55: 695 4雷虹，曹雪濤，于益芝 et al. 重組腺病毒介導IFN-基因轉染的巨噬細胞的體外免疫效應功能分析. 中國免疫學雜志，1997；13(3)：131 5Cox G W， Mathieson B J， Giardina S L et al. Characterization of IL-2 rece

26、ptor expression and function on murine macrophages. J Immunol， 1990； 145: 1719 6Espinoza Delgado I， Bosco M C， Musso T et al. Interleukin-2 and human monocyte activation. J Leukoc Biol， 1995； 57: 13 7Hennemann B， Beckmann G， Eichlmann A et al. Phase I trial of adoptive immunotherapy of cancer patients using monocyte-derived macrophages activated with interferon and lipopolysaccharide. Cancer Immunol Immunother， 1998； 45: 250 8He