超臨界流體萃取技術(shù)在中草藥及天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用(1)

1、超臨界流體萃取技術(shù)在中草藥及天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用*(1)    【摘要】   在過去的十幾年，超臨界流體萃取技術(shù)從天然產(chǎn)物和中草藥中已經(jīng)成功地萃取和分離了多種活性成分，本文主要針對超臨界流體萃取技術(shù)在實際應(yīng)用方面的幾個問題進(jìn)行綜述，包括提攜劑的選取、樣品的制備、萃取溫度和壓力的影響、萃取物的采集方法等幾個方面。        【關(guān)鍵詞】   超臨界流體萃?。恢胁菟?；天然產(chǎn)物；綜述        【

2、Abstract】  In the past decade， supercritical fluid extraction(SFE) technology has been successfully applied to the extraction and separation of a variety of active compounds from herbs and natural plants. This paper reviewed a few aspects of SFE application in selection of modifiers， sample pre

3、paration， effects of pressure and temperature， collection methods.          【Key words】  supercritical fluid extraction； herbal； natural product；review        中草藥及天然產(chǎn)物中有效成分的提取， 直接關(guān)系到產(chǎn)品有效成分的含量，影響其內(nèi)在質(zhì)量、臨床療效、經(jīng)濟(jì)效益及GMP的實施。傳統(tǒng)提取中草藥有效成分的方

4、法有水蒸氣蒸餾法、減壓蒸餾法、溶劑萃取法等，這些方法通常是工藝復(fù)雜、耗時、產(chǎn)品純度不高、對環(huán)境污染大，而且易殘留有害物質(zhì)。所以科研工作者們一直在試圖尋找提取效率高、選擇性好、污染小的方法，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，涌現(xiàn)出了許多新的分離提取方法，加快了提取過程，提高了提取效率。超臨界流體萃取技術(shù)就是其中之一，較傳統(tǒng)提取方法而言，該方法具有簡便、快速、提取率高、無污染等特點。        早在1879年，Hannay等就發(fā)現(xiàn)超臨界乙醇流體對無機(jī)鹽固體具有顯著的溶解能力，但超臨界流體萃取(supercritical gluid extr

5、action，SFE)卻是在近30年來才迅速發(fā)展起來的一種新型物質(zhì)分離、精制技術(shù)3，4。所謂超臨界流體（supercritical fluid， SCF）是指物質(zhì)處于臨界溫度和臨界壓力時，成為單一相態(tài)，即超臨界流體，在超臨界狀態(tài)下，流體的性質(zhì)介于氣體和液體之間，既具有與氣體接近的粘度及高的擴(kuò)散系數(shù)，又具有與液體相近的密度。在超臨界點附近壓力和溫度的微小變化都可以引起流體密度很大的變化，并相應(yīng)地表現(xiàn)為溶解度的變化， 因此可以利用溫度和壓力的變化來實現(xiàn)萃取和分離的過程。超臨界流體萃取技術(shù)具有萃取速度快、提取率高、產(chǎn)品純度好、流程簡單、能耗低、過程無有機(jī)溶劑殘留等優(yōu)點5。目前超臨界流體研究范圍涉及食

6、品、香料、醫(yī)藥、化工、環(huán)保等領(lǐng)域614，并取得了一系列的研究進(jìn)展。本文就超臨界流體萃取技術(shù)在中草藥及天然產(chǎn)物中有效成分的分離提取中實際操作方面的幾個問題進(jìn)行綜述，包括樣品的制備、提攜劑的選擇、萃取溫度和壓力的影響、萃取產(chǎn)物的采集方法等。        1  超臨界流體萃取技術(shù)的主要特點1424        1.1  超臨界流體的特點  超臨界流體既具有液體對溶質(zhì)有比較大溶解度的特點，又具有氣體易于擴(kuò)散和運動的特性，傳質(zhì)速率大大高于液相過程(超臨

7、界流體的擴(kuò)散系數(shù)為10-4cm2/s，液體的擴(kuò)散系數(shù)為10-5 cm2/s)。也就是說超臨界流體兼具氣體和液體的性質(zhì)，即具有較低的粘度和較高的擴(kuò)散力。所以超臨界流體萃取率高，萃取速度快。        1.2  萃取和分離合二為一  當(dāng)飽含溶解物的超臨界流體流經(jīng)分離器時，由于壓力下降使得流體與萃取物迅速成為兩相（氣液分離）而立即分開，不存在物料的相變過程，無需回收溶劑，操作方便；不僅萃取效率高，而且能耗較少，節(jié)約成本。        1.3  超

8、臨界流體萃取通常在較低溫度下進(jìn)行  可以有效地防止熱敏性成分的氧化和逸散，特別適合于那些對熱敏感性強(qiáng)、容易氧化分解成分的分離提取。        1.4  超臨界二氧化碳流體常態(tài)下是氣體， 無毒  與萃取成分分離后， 完全沒有溶劑的殘留， 有效地解決了傳統(tǒng)提取方法的溶劑殘留問題。        1.5  流體的溶解能力與其密度的大小相關(guān)  而溫度、壓力的微小變化都會引起流體密度的大幅度變化， 并相應(yīng)地表現(xiàn)為溶解度的變化。因此，

9、可以利用壓力、溫度的變化來實現(xiàn)萃取和分離的過程。        1.6  提取速度快、生產(chǎn)周期短  超臨界二氧化碳提取（動態(tài)）循環(huán)一開始，分離便開始進(jìn)行。一般提取10min便有成分分離析出，24h便可完全提取。同時它無需濃縮等步驟，即便加入提攜劑，也可通過分離功能除去。        1.7  分離工藝流程簡單  超臨界萃取只由萃取器和分離器2部分組成，不需要溶劑回收設(shè)備，操作方便，節(jié)省勞動力和大量有機(jī)溶劑，減小污染。而且操作參數(shù)容易控

10、制，因此，有效成分及產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控。        1.8  超臨界二氧化碳流體萃取能應(yīng)用到不同類型的系統(tǒng)中33  如： 分析型設(shè)備（萃取釜容積一般在500ml以下），中試設(shè)備（120L），以及工業(yè)化生產(chǎn)裝置（萃取釜容積50L至數(shù)立方米）等。        2  超臨界二氧化碳流體萃取流體        雖然超臨界流體的溶劑效應(yīng)普遍存在，但實際上需要考慮溶解度、選擇性、臨界點數(shù)據(jù)以及化

11、學(xué)反應(yīng)的可能性等一系列因素，因而文獻(xiàn)上常采用的臨界點流體溶劑并不太多24，而以二氧化碳應(yīng)用最廣泛，因為二氧化碳超臨界密度大，溶解能力強(qiáng)，傳質(zhì)速率高；臨界壓力（7.39MPa）適中，臨界溫度31.06，分離過程可在接近室溫條件下進(jìn)行；便宜易得，無毒，惰性以及極易從萃取產(chǎn)物中分離出來等一系列優(yōu)點，當(dāng)前絕大部分超臨界流體萃取都以二氧化碳為溶劑。由于二氧化碳是一種非極性溶劑，所以二氧化碳流體最適合萃取親脂性的化合物。        對于極性化合物的萃取，通常選用極性較強(qiáng)的流體物質(zhì)，如： CHClF2 (Freon-22) 和NO22529。但

12、是由于NO2流體容易產(chǎn)生爆炸，CHClF2破壞大氣的臭氧層，極大地限制了兩種流體的應(yīng)用。        水也可作為超臨界流體材料（水的臨界溫度為374.2，臨界壓力為22MPa）3035，雖然它對極性化合物有較高的萃取率，但是由于需要較高的溫度，所以不適合萃取那些對熱敏感性強(qiáng)、容易分解的物質(zhì)，而且在高溫條件下水中的氧有腐蝕性，不僅使有機(jī)成分分解，而且可能破壞萃取罐。 所以超臨界水流體在實際應(yīng)用中有很大的局限性。        本文主要討論超臨界二氧化碳流體的應(yīng)用，其他的超臨界

13、流體在這里不做討論。        3  提攜劑        在超臨界流體萃取過程中， 由于二氧化碳是非極性物質(zhì)，比較適合于脂溶性物質(zhì)的萃取，但對極性較強(qiáng)的物質(zhì)來說， 其溶解能力明顯不足，此時， 為增加二氧化碳流體的溶解性能，通常在其中加入少量極性溶劑，以增加其溶解能力， 這種溶劑稱為提攜劑（entrainer），也稱夾帶劑或修飾劑(cosolvent， modifier)。提攜劑通常是有機(jī)溶劑，它可以是某一種純物質(zhì)，也可以是兩種或多種物質(zhì)的混合物。提攜劑的加入可

14、以大大提高難溶化合物的溶解度，提高萃取效率，降低萃取時間，但是其作用機(jī)制至今仍不清楚，可能是由于提攜劑與溶質(zhì)分子之間的范德華作用力，或與溶質(zhì)之間形成氫鍵及其他各種化學(xué)作用力等影響了溶質(zhì)在超臨界流體中的溶解度與選擇性；另外，在溶劑的臨界點附近，溶質(zhì)溶解度對溫度、壓力的變化最為敏感，加入提攜劑后，混合溶劑的臨界點相應(yīng)改變，如能更接近萃取溫度，則可增加溶解度對溫度、壓力的敏感程度3638。        Hawthorne等39使用超臨界二氧化碳流體萃取薄荷和青蘭中的精油時，在500g的樣品中只加入了0.5ml的CH2Cl2，萃取時間就由9

15、0min 降低到30min，而萃取率與采用水蒸氣蒸餾法提取4h的結(jié)果一致； Lin等40萃取黃芩根中極性比較大的黃酮類化合物時，加入濃度為70%的乙醇后，提取率比常規(guī)方法提高了12.6% ；姜繼祖等41采用超臨界二氧化碳流體萃取光菇子中秋水仙堿時，加入濃度為76的乙醇做提攜劑，結(jié)果萃取率提高了1.25倍。        據(jù)文獻(xiàn)報道，在天然植物的提取中，至少使用過17種提攜劑42，有水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等，其中， 乙醇是最常用的一種，雖然乙醇的極性不如甲醇，但是由于乙醇無毒且易與二氧化碳混合，所以在天然植物的超臨界二氧化碳流體

16、萃取中，廣泛采用乙醇做提攜劑4351。水也可以做提攜劑，Ling52和Saldana等53在研究中發(fā)現(xiàn)，樣品中含有約10% 的濕度時，可以大大提高萃取率；Miyachi 等54用水做提攜劑，成功地萃取了木酚素和黃酮類化合物。實驗還發(fā)現(xiàn)， 水和甲醇及水和乙醇的混合溶液做提攜劑時， 比單純用甲醇和乙醇的效果好，可能是由于水能增加提攜劑的極性，更有利于極性化合物的提取，Lin等40在提取黃芩根中的黃酮時發(fā)現(xiàn)， 使用70%的甲醇作提攜劑時， 其萃取率比純甲醇作提攜劑高1倍；筆者55采用超臨界二氧化碳流體萃取朝鮮淫羊藿中的總黃酮時，也發(fā)現(xiàn)用70的乙醇做提攜劑時其萃取效果比用純乙醇高；Anu56和Jani

17、cot 等57在超臨界二氧化碳流體萃取的研究中也證實了這一點。        此外，在超臨界流體萃取過程中，還可以根據(jù)需要采用不同的提攜劑進(jìn)行分步萃取，可以得到不同的產(chǎn)物，Palma 等58用超臨界流體萃取葡萄籽中的酚類化合物時就采取2步萃取，首先采用純二氧化碳作為超臨界流體進(jìn)行萃取時， 主要得到脂肪酸、脂肪族醛類和甾酮類化合物，然后再采用甲醇做提攜劑進(jìn)行萃取， 主要得到表兒茶酸和五倍子酸；Sargenti等59用超臨界二氧化碳流體萃取檸檬草時，采用3步萃取，分別加入正己烷、丙酮、甲醇做提攜劑，得到不同的產(chǎn)物?？傊?，采用何種提攜劑主要

18、取決于樣品及產(chǎn)物的性質(zhì)，并通過初步試驗確定最佳提攜劑60，61。        雖然加入提攜劑能夠在一定程度上提高萃取率，但是同時也萃取出了更多的雜質(zhì)，使選擇性降低62，63。此外， 如果提攜劑的濃度不合適，反而會降低萃取率，Sanagi 等64采用超臨界二氧化碳流體萃取可可豆中吡嗪，實驗結(jié)果表明， 當(dāng)采用2%甲醇和5%二氯甲烷做提攜劑時，萃取率升高，而采用5%甲醇和2%二氯甲烷做提攜劑時，萃取率反而下降。事實上，并不是所有的超臨界二氧化碳流體萃取 過程都需要提攜劑，Ashraf-Khorassani 等65從醉椒根中萃取了7種內(nèi)酯，

19、用純二氧化碳流體時萃取率基本上都超過90%，加入乙醇做提攜劑萃取率沒有顯著提高。據(jù)報道甚至三萜類化合物在比較溫和的超臨界二氧化碳流體萃取條件下，當(dāng)無提攜劑存在時，也能獲得比較滿意的萃取率66。        提攜劑的加入方式通常有3種54，60，64，67：(1)是萃取前將提攜劑直接注入到樣品基質(zhì)中，這種方法是最簡單、最經(jīng)濟(jì)的方法，但重現(xiàn)性差，是目前最簡單的近似評價不同提攜劑的方法；(2)是將提攜劑與液體二氧化碳在鋼瓶中預(yù)混；(3)是用另一泵注入提攜劑，該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。     

20、60;  4  樣品的制備        樣品顆粒的大小及濕度情況是影響超臨界萃取過程的重要因素。        如果樣品顆粒大，流體滲透速度慢，則萃取時間將延長。Reverchon等67在羅勒葉的超臨界二氧化碳流體萃取中發(fā)現(xiàn)，研磨成粉的樣品(其粒度在0.17mm左右)，2h就可萃取完全，而樣品顆粒為0.55mm時，萃取5h仍然得不到滿意的萃取率。所以顆粒小的樣品能加快萃取速度，提高萃取率68，但如果顆粒過細(xì)則影響流體的正常流速，此時，可通過在樣品中填充玻

21、璃珠、沙子等解決這一問題6971，其作用是這些沙?？梢苑乐箻悠繁粩D壓成結(jié)實的、不能滲透的硬塞，從而保持流體在樣品中的正常滲透69，70。此外，在超臨界二氧化碳流體萃取槽入口的末端安裝一個金屬過濾器，也有助于保持流體穩(wěn)定的流速，避免形成流體溝70。        在中草藥及天然產(chǎn)物的超臨界萃取過程中，當(dāng)萃取產(chǎn)物揮發(fā)性很強(qiáng)或非常不穩(wěn)定時，萃取時需要新鮮的樣品，此時， 樣品的濕度比較大，在萃取過程中水分容易形成冰堵塞限流器。Lehotay72報道，當(dāng)大約0.3% 的水溶解在超臨界二氧化碳流體中，萃取率可明顯提高，而過量的水留在萃取缸中，會使

22、一些易溶于水的物質(zhì)進(jìn)入水相，使萃取率降低。除去水的最簡單有效的方法是加入無水Na2SO4，因為無水Na2SO4既能使流體和樣品有效的接觸提高萃取率，又能吸收一定的水分，保留有效的濕度73。Polesello22和Lang等74還發(fā)現(xiàn)，在樣品中加入硅膠也可以很好地除去水分。Miller等72用硅藻土與含水樣品混合制成顆粒，也能有效的吸收水分。適當(dāng)加熱限流器，也是有效地解決堵塞的方法39，48。此外，加入提攜劑也是一個簡單而有效地解決堵塞的方法75，Weathers 等75在用超臨界二氧化碳流體萃取濕紅辣椒中的-胡蘿卜素時，加入的2，2-二甲氧基丙烷，不但是提攜劑，又起到了干燥劑的作用。Heato

23、n等76用超臨界二氧化碳流體萃取紫杉中的紫杉烷類成分時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提攜劑甲醇的濃度超過5%時，限流器就不容易被石蠟等物質(zhì)堵塞。        超臨界二氧化碳流體萃取經(jīng)常選用干燥的樣品，樣品的干燥過程影響萃取的產(chǎn)率和質(zhì)量。根據(jù)文獻(xiàn)報道，主要有如下幾種干燥方式45，46，60，70，7780：冷凍干燥、烘箱干燥、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥、自然干燥等?？筛鶕?jù)樣品及萃取產(chǎn)物的性質(zhì)選擇合適的干燥方法。        5  壓力與溫度在超臨界二氧化碳流體萃取中的作用  

24、      在超臨界萃取過程中，壓力和溫度是兩個最重要的物理參數(shù)，因為流體密度是壓力和溫度的函數(shù)，而流體密度決定物質(zhì)的溶解度，進(jìn)而影響超臨界二氧化碳流體萃取的萃取率4781。同時還應(yīng)該著重指出的是，物質(zhì)在超臨界流體中的溶解度由兩個因素決定，即物質(zhì)的揮發(fā)性（是溫度的函數(shù)）和流體的溶劑化效應(yīng)（是流體密度的函數(shù)）47。在超臨界區(qū)域，流體密度可以在很寬的范圍內(nèi)變化，即壓力或溫度的微小變化，均可以大幅度改變流體密度。        溫度一定時，萃取壓力越高，流體的密度越大，對溶質(zhì)的溶解力越強(qiáng)， 但是過高的

25、萃取壓力會受到設(shè)備的限制。極性官能團(tuán)（如羥基官能團(tuán)）的數(shù)量影響溶質(zhì)的溶解度，需要較高的萃取壓力。Stahl 等82的實驗結(jié)果表明， 在壓力低于300bar時，可以選擇性地萃取含有3個羥基的類固醇，但對含有4個羥基的類固醇，或含有3個羥基1個羧基的類固醇及含有1個酚羥基和2個其他羥基的類固醇卻無法萃取出來。Weathers等76在萃取辣椒粉中的-胡蘿卜素時觀察到，當(dāng)壓力從338bar降到250bar時，相應(yīng)的流體密度降低，萃取率急劇下降。采用超臨界萃取五味子中的木酚素時，Choi等83發(fā)現(xiàn)，如果萃取時間足夠長（30min/100mg樣品），溫度（4080）和壓力(135340bar)對木酚素的萃

26、取率沒有明顯的影響，但是如果萃取6min，則增大壓力能顯著提高萃取率。        為了在超臨界二氧化碳流體萃取過程中得到較好的選擇性，流體密度是至關(guān)重要的參數(shù)。Gawdzik 等84在實驗中發(fā)現(xiàn)，在60最佳溫度條件下，流體密度控制在0.3g/ml時，萃取物幾乎都是所需要的化合物。萃取揮發(fā)性化合物時如果壓力過大，流體密度超過0.80g/ml容易導(dǎo)致甘油三酸酯萃取出來，不但影響萃取物的純度，而且容易造成限流器堵塞71，85。Chouchi等86在對橙皮進(jìn)行超臨界二氧化碳流體萃取時，確定了最佳實驗條件為40、77bar（二氧化碳流體密度

27、為0.25g/ml），并且在實驗中發(fā)現(xiàn)高流體密度會降低萃取的選擇性。超臨界二氧化碳流體萃取迷迭香、羅勒屬及牛至屬葉中的精油，最佳萃取條件是溫度為4050，壓力為80100bar67。        通過控制壓力，即改變流體密度，可以分餾得到不同的產(chǎn)物。Ibanez等77用兩步超臨界二氧化碳流體萃取法， 從迷迭香葉中分別得到精油和抗氧化成分，完成第一步的萃取條件是40、100bar，第二步萃取是在60、400bar的條件下進(jìn)行的。采用不同流體密度還可以進(jìn)一步分離萃取物，提高選擇性， Marongiu等80用超臨界二氧化碳流體萃取幾種植物

28、葉中的精油，在壓力90bar、溫度-5時，首先在第一個分離器沉淀出一些石蠟；然后控制壓力為1520bar，溫度為1521，在第二分離罐得到揮發(fā)油部分。Reverchon 等67也采用這種方法將萃取物中的石蠟與精油分開。        如果被萃取物不是易揮發(fā)性物質(zhì)，在超臨界二氧化碳流體萃取過程中則需要較高的流體密度。Chun 等47用超臨界二氧化碳流體萃取紫杉樹針時，在300 atm、40才能得到需要的產(chǎn)物， 而在100atm、40，即較低的流體密度條件下，萃取物只有石蠟。用超臨界二氧化碳流體萃取文朵靈生物堿，在最高的流體密度時，得到了

29、最高的提取率。Marleny 等51用超臨界二氧化碳流體萃取提取二甲麥角新堿時，當(dāng)溫度保持70不變，壓力由100bar 增加到400bar時，萃取率提高了85倍，如果在較低的溫度和壓力下，要想得到相同的萃取率，則需要消耗大量的時間和二氧化碳。此外， 在進(jìn)行秋水仙堿等生物堿萃取時，用3% 甲醇做提攜劑，當(dāng)二氧化碳流體密度由0.8g/ml增加到0.9g/ml (247bar)，各種生物堿萃取率增加23倍，而壓力不變，溫度由35升到40，各種生物堿的總提取率變化很小87。        溫度對超臨界流體溶解能力的影響比較復(fù)雜，壓力一定時，隨著溫度的升高，一方面二氧化碳流體密度降低，導(dǎo)致二氧化碳流體的溶劑化效應(yīng)下降，使物質(zhì)在其中的溶解度下降；另一方面物質(zhì)的蒸氣壓增大，使物質(zhì)在二氧化碳流體中的溶解度增大。當(dāng)前者占主導(dǎo)地位時，溶解度呈下降趨勢，后者占主要地位，溶解度呈上升趨勢。Lin 等58采用超臨界二氧化碳流體萃取