中國甜柿自然脫澀相關(guān)基因ADH和PDC的分離及功能驗證

1、中國甜柿自然脫澀相關(guān)基因ADH和 PDC的分離及功能驗證中國原產(chǎn)完全甜柿 ( 簡稱“中國甜柿”或CPCNA)自然脫澀性狀受顯性基因控制 , 而日本原產(chǎn)完全甜柿 ( 簡稱“日本甜柿”或 JPCNA)受隱性基因控制 , 因而中國甜柿較日本甜柿具有更重要的育種價值。 中國甜柿自然脫澀機(jī)理明顯有別于僅依靠“稀釋效應(yīng)”的日本甜柿 , 除“稀釋效應(yīng)”外可能還涉及單寧的“凝固效應(yīng)” ,即可溶性單寧與乙醛反應(yīng)轉(zhuǎn)變成不溶性單寧的過程。本研究以中國甜柿為試材, 以非完全甜柿 (non-PCNA)和日本甜柿為對照 , 首先從中國甜柿中分離參與乙醛代謝的兩個關(guān)鍵酶基因: 乙醇脫氫酶基因 (ADH)和丙酮酸脫羧酶基因

2、(PDC); 進(jìn)而通過分析其在不同脫澀類型( 中國甜柿、日本甜柿和非完全甜柿 ) 、不同發(fā)育階段 ( 花后 5、 10、15、 20 和 25 周) 、不同部位 ( 花、葉片、萼片、果皮、果肉、果心和種子) 表達(dá)模式差異并結(jié)合單寧含量及乙醇和乙醛含量分析 , 篩選與中國甜柿可溶性單寧的自然凝固直接有關(guān)的目標(biāo)基因; 此外 , 通過構(gòu)建瞬時轉(zhuǎn)化體系 , 進(jìn)一步確認(rèn)候選目標(biāo)基因的功能 , 以期從分子水平解析中國甜柿自然脫澀機(jī)理。 主要研究結(jié)果如下 :1. 以 GFP作為報告基因 , 基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射滲透法 , 建立適宜栽培柿基因功能驗證的活體葉片瞬時超表達(dá)體系。通過乙酰丁香酮濃度、 菌液濃度和注

3、射后不同采樣時間對瞬時轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化 , 且該體系適用于不同脫澀類型柿品種磨盤柿 (non-PCNA)、鄂柿 1號 (CPCNA)和寶蓋甜柿 (CPCNA)。將 DkLAC1瞬時轉(zhuǎn)化磨盤柿和鄂柿1 號葉片 , 發(fā)現(xiàn) DkLAC1表達(dá)導(dǎo)致兩個柿品種葉片原花青素含量升高。2. 基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射滲透法 , 建立 ihpRNA(發(fā)夾 RNA)誘導(dǎo)的柿活體葉片基因瞬時沉默技術(shù)。 DkPDS被選擇作為內(nèi)源報告基因 , 用于評價該瞬時沉默體系。利用該技術(shù)將 pHG-LAR(DkLAR基因 ihpRNA干涉載體 ) 瞬時轉(zhuǎn)化磨盤柿 、鄂柿 1 號和陽豐 活體葉片 , 利用 DMACA染色及 Folin

4、-Ciocalteau法測定原花青素含量 , 結(jié)果顯示 DkLAR瞬時沉默均導(dǎo)致柿葉片原花青素含量顯著降低,表明 DkLAR參與柿原花青素的生物合成。3. 基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法, 建立柿組培苗瞬時轉(zhuǎn)化體系。在真空滲透 20min 條件下 GUS基因瞬時轉(zhuǎn)化效率最高。利用該技術(shù)將pHG-LAR(DkLAR基因 ihpRNA干涉載體 ) 瞬時轉(zhuǎn)化小果甜柿和磨盤柿組培苗 , 利用 DMACA染色及 Folin-Ciocalteau法測定原花青素含量 , 結(jié)果顯示 DkLAR瞬時沉默導(dǎo)致兩個柿品種組培苗葉片原花青素含量顯著降低。進(jìn)一步證實 DkLAR在柿原花青素生物合成中具有重要的作用。4. 中

5、國甜柿可溶性單寧累積持續(xù)到果實發(fā)育后期。在花后 20-25 周(WAF),其可溶性單寧含量迅速降低并完成自然脫澀過程, 且不溶性單寧含量在果實發(fā)育后期(15-25 WAF) 快速上升 , 表明中國甜柿自然脫澀可能涉及可溶性單寧的凝固。 非完全甜柿果實直至成熟期其可溶性單寧含量仍維持較高水平。日本甜柿在果實早期 (10 WAF前 ) 停止可溶性單寧的累積 , 并通過“稀釋效應(yīng)”完成自然脫澀過程。 5. 從中國甜柿中分離3 個 ADH基因家族成員 (DkADH1、DkADH2和 DkADH3)和 4 個 PDC基因家族成員 (DkPDC1、DkPDC2、DkPDC3和 DkPDC4)。其中 DkA

6、DH1、DkADH2、DkADH3、 DkPDC2和 DkPDC3均獲得 cDNA全長序列 ,其 ORF序列分別為 1140 bp 、1137 bp 、1044 bp 、 1824 bp 和 1743 bp 。6.ADH和 PDC時空表達(dá)分析結(jié)果顯示 , 在中國甜柿果實發(fā)育后期 , 即不溶性單寧含量快速上升期間 (15-25 WAF),DkADH1、DkPDC1和 DkPDC2特異性上調(diào)表達(dá) ; 且在種子中 ADH和 PDC高量表達(dá) , 尤其是 DkADH1、 DkPDC1和 DkPDC2。這表明 DkADH1、DkPDC1和 DkPDC2可能與中國甜柿單寧凝固具有密切的關(guān)系。7. 不同發(fā)育時

7、期果肉和種子乙醇和乙醛含量測定的結(jié)果表明 , 種子中乙醇和乙醛含量均高于果肉。中國甜柿和日本甜柿種子乙醛含量隨果實發(fā)育不斷升高 , 乙醇含量在果實發(fā)育早期較高 , 而后隨果實發(fā)育不斷降低。 尤其在果實發(fā)育后期 (20-25WAF), 中國甜柿種子乙醛含量快速上升 , 與其不溶性單寧含量變化趨勢一致。果肉中乙醇含量均隨果實發(fā)育而不斷降低。 中國甜柿和非完全甜柿果肉乙醛含量也隨果實發(fā)育不斷降低 , 而日本甜柿與之相反。8. 采用磨盤柿葉片的瞬時遺傳轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果顯示 ,DkADH1和 DkPDC2超表達(dá)均能顯著降低葉片可溶性單寧含量。綜上所述 , 基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射滲透和真空滲透法 , 本研究建立了柿活體葉片和組培苗的瞬時轉(zhuǎn)化體系。研究結(jié)果認(rèn)為 , 中國甜柿自然脫澀