基因組半定量PCR方法檢測腫瘤組織的基因缺失

1、    基因組半定量PCR方法檢測腫瘤組織的基因缺失        摘要：目的用PCR方法檢測腫瘤組織中抑癌基因的缺失狀況。方法PCR半定量技術。結果10對標本有5對發(fā)現(xiàn)缺失，80 %與Southern 雜交結果相符合。結論半定量PCR技術可以替代Southern雜交，成為檢測基因缺失的一種便利手段。關鍵詞：基因缺失；PCR中分類號：Q503文獻標識碼：A文章編號：1000-7431(2000)02-0135-03DETERMINATION OF GENE DELETION

2、IN TUMOR TISSUE BY SEMI-QUANTITATIVE POLYMERASE CHAIN REACTIONSUN Fen-yongWAN Da-fangQIN Wen-xin（National Laboratory for Oncogene and Related Genes,Shanghai Cancer Institute （Shanghai 200032,China）Abstract：ObjectiveTo determine the deletion of tumor suppressor gene in tumor tissue by PCR.MethodsSemi

3、-quantitative PCR assay.Results5/10 of the samples with partially loss of the SFY gene had been picked out by this method,and 80 % of them had been confirmed by Southern blot.ConclusionSemi-quantitative PCR technique can replace Southern blot to be a convenient way to investigate gene deletion in tu

4、mor tissue.Key words：Gene deletion；Semi-quantitative PCR隨著分子生物學技術的發(fā)展，出現(xiàn)了多種不同的染色體缺失檢測技術，應用最廣的是染色體遺傳位標多態(tài)性檢測和Southern雜交技術，但前者依賴于待檢區(qū)域內多態(tài)位標的存在，后者雖然無此要求，但仍有較多問題：1)模板用量大，2)步驟煩瑣，同位素用量大，3)依賴于限制性酶切片段長度的多態(tài)性，若內切酶選擇失當，很難正確反映缺失情況，4)對于純合子的單等位基因缺失，雜交方法無法檢測。最近，本實驗室利用YAC和BAC為探針，篩選了正常人肝cDNA文庫，得到一批肝癌相關抑癌基因候選陽性克隆，本研究嘗試用

5、半定量PCR技術替代Southern雜交，對其中的陽性克隆SFY在肝癌組織中的缺失狀況進行檢測。材料與方法材料PCR擴增試劑盒(Promga)，PCR循環(huán)儀(Genius)，GelDoc1000(BioRad),Du7500紫外分光光度儀(Beckman)。方法10對肝癌和癌旁組織標本，酚/氯仿抽提DNA，紫外分光法定量。PCR反應體系為5l：10×buffer,15 mmol/L Mg2+，1 mmol/L dNTP各0.5 l，18.5KBq -32PdATP,模板20 ng,引物終濃度0.5 mol/L，0.2 U Taq酶，MinQ水補足體積。反應條件：94 4 min，94

6、、60、72各30s，25個循環(huán)，72 10 min。取產(chǎn)物2.5 l行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓150V，曝光8 h，用GelDoc1000測定感光強度，按下述公式測定R值：R=D待檢-D背景/D內參-D背景其中R為待檢基因參照于內參的相對量，D待檢和D內參分別為待測產(chǎn)物及內參的感光強度，D背景為相同面積背景強度。Southern雜交按分子克隆介紹方法進行7，酶切使用MspI和EcoRI，探針為本實驗室篩庫所得的陽性噬菌體亞克隆產(chǎn)物。結果首先研究本系統(tǒng)條件下，PCR循環(huán)數(shù)與產(chǎn)物的關系，發(fā)現(xiàn)28個循環(huán)內，PCR擴增處于指數(shù)期(見1)，考慮到定量的準確性，同時又有足夠的產(chǎn)量以便觀察，本實驗采用25

7、個循環(huán)。作者選用一個高度肝癌相關的侯選抑癌基因SFY作為對象，Southern雜交檢測該基因在10對肝癌及癌旁標本中的狀況，發(fā)現(xiàn)其中5只腫瘤標本有顯著的LOH(Loss of heterozygosity)(見2)。應用PCR半定量方法檢測SFY基因在上述10對標本中的缺失狀況，PCR產(chǎn)物為該基因一個外顯子，大小135bp，內參為-actin,產(chǎn)物大小350bp。作者設定：R癌/R癌旁2/31PCR循環(huán)數(shù)與產(chǎn)量關系當循環(huán)數(shù)小于28次時，產(chǎn)量呈線性增加為判斷LOH的標準，結果顯示共有5只腫瘤標本發(fā)生LOH，其中4只與Southern雜交結果相符，符合率為80 %，另有一對標本未被Southern

8、雜交檢出(見表1和3)。2Southern雜交檢測標本G5，Q9其中G5發(fā)生LOH L：癌旁組織，K：癌組織表1GelDoc1000測定發(fā)生LOH的感光強度G3G5G8Q6D12LKLKLKLKLKDSFY8012885135931347210664119D-actin131135140130157155167156136133D背景192192192192192192192206206206R1.841.122.060.922.831.573.622.002.031.19RK/RL0.610.450.550.550.59單位：PDU(pixel density unit);L:癌旁組織；K：

9、肝癌組織；R=RK/RL=DSFY-D背景/D-actin-D背景 3基因組半定量PCR檢測標本G3，G5，G6，G8其中G3，G5，G8的癌組織中SFY基因PCR產(chǎn)量較癌旁明顯減少，即發(fā)生部分缺失。L：癌旁組織K：癌組織討論許多研究者一直致力于用PCR技術對基因組進行定量的工作。數(shù)年前，有人用該技術成功地篩選到Duchenne/Becker肌萎縮相關基因的幾個高缺失區(qū)，并可診斷出缺失基因的攜帶者(一對等位基因中丟失一個基因)，使此方法成為該領域的熱點13，6。Pastire報道，他們的系統(tǒng)可以檢測出基因拷貝數(shù)1/3的差異4。一般認為PCR反應分兩個階段：指數(shù)期和平臺期4，5。指數(shù)期內，產(chǎn)物擴

10、增倍數(shù)與擴增效率的對數(shù)呈線性關系，適合定量。但若將內參與靶基因分開擴增，不同反應的擴增效率不同，內參失去意義，許多報道中，采用這種方法缺乏根據(jù)。本研究對兩者行雙重PCR擴增，增加了定量的科學性。平臺期內，由于產(chǎn)物增加緩慢，不適于定量。在我們的反應體系中，循環(huán)數(shù)小于28為指數(shù)期，因此本實驗選擇25個循環(huán)。此時產(chǎn)量較小，須用-32P dATP摻入法，而一些報道中使用EB染色進行定量，可信度令人懷疑。在確定LOH標準時，一般認為LOH是單個等位基因的缺失，因此，只有當R癌/R癌旁1/2時才有LOH的產(chǎn)生，結果5對LOH標本中只有1對符合這一標準，考慮到癌組織中存在少量正常組織，以及標本收集時癌和正常

11、組織的確定有一定的人為誤差，最后將LOH的標準放寬到R癌/R癌旁2/34，使LOH檢出符合率達到80%(相對于Southern雜交)，證明這一標準較為合理，其中有一對Southern雜交結果為陽性，而此方法為陰性，可能與腫瘤標本中污染有正常組織有關。另外，有一標本Southern雜交檢測未發(fā)現(xiàn)缺失，而本方法發(fā)現(xiàn)有明顯的LOH，經(jīng)過重復，排除了偶然誤差的影響后，仍然是相同的結果。作者認為，用雜交檢測缺失依賴于限制性酶切片段長度的多態(tài)性，若內切酶選擇不適當，很難正確反應基因缺失的實際情況，事實上對于每一個標本都找到最適當?shù)拿甘遣豢赡艿?，此外，若待檢基因為純合子，雜交法也將無能為力。本方法則直接從基

12、因的拷貝數(shù)出發(fā)，檢測待檢基因的狀態(tài)，增加了檢測的敏感性。綜上所述，由于本方法反應體系小，同位素有量少，操作簡便，周期短，有較高的敏感性，而且可以彌補Southern雜交的不足，因此是一種檢測染色體缺失的好方法，特別是對大量標本進行檢測時，用作初步篩選，并以其它方法相配合，不失為一種較理想的方案。基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃資助項目(G1998051209)作者簡介：孫奮勇，男，博士研究生作者單位：孫奮勇（上海市腫瘤研究所癌基因及相關基因國家重點實險室上海 200032）?萬大方（現(xiàn)在江蘇省中西醫(yī)結合研究所分子生物學研究室南京210037）覃文新（現(xiàn)在江蘇省中西醫(yī)結合研究所分子生物學研究室

13、南京210037）顧健人（現(xiàn)在江蘇省中西醫(yī)結合研究所分子生物學研究室南京210037）參考文獻1Abbs S,Bobrow M,Kleanthous K.Analysis of quantitative PCR for the diagnosis of deletion and duplication carriers in the dystrophy geneJ.J Med Genet,1992,29:1912Ioannou P,Christopoulous G,Panayides K,et al.Detection of Duchenne and Becker muscular dystr

14、ophy carriers by quantitative multiple polymerase chain reaction analysisJ.Neurology,1992,42:17833Mansfield ES,Robertson JM,Lebo RV,et al.Duchenne/Becker muscular dystrophy carrier detection using quantitative PCR and fluorescence-based strategiesJ.Am J Med Genet,1993,48:2004Lucio P,Maria GC,Giulia

15、F,et al.A quantitative polymerase chain reaction assay completely discriminates between Duchenc and Becker muscular dystrophy deletion carriers and normal femalesJ.Mol Cell Probes,1996,10:1295Lubin MB,Toyoda H,Middleton M,et al.Precise gene dosage determination by polymerase chain reaction:theory,methodology,and statistical approachJ.Mol Cell Probes,1991,5:3076Beggs AH,Koenig M,Tedeshi S,et al.D