發(fā)酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的測(cè)定研(精)

1、發(fā)酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的測(cè)定研究彭輝才1粱明振1'張宏福2（1廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，廣西南寧530005;2北京畜牧獸醫(yī)研究所營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京海淀區(qū)100094摘要:豆粕中最主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子是胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原；本試驗(yàn)對(duì)8種發(fā)酵豆 粕進(jìn)行測(cè)定，前兩者含量極低未檢出。用 SDS-PAGE凝膠電泳定性檢測(cè)大豆抗原中的 B 一伴大豆球蛋 白（B-COnglycinin和大豆球蛋白（Glycinin,6種條帶模糊，抗原消失，結(jié)果表明，生物發(fā)酵是一種有效的鈍化抗?fàn)I養(yǎng)因子的方法。關(guān)健詞:胰蛋白酶抑制因子凝集素13一伴大豆球蛋白大豆球蛋白測(cè)定

2、發(fā)酵豆粕指是通過(guò)現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)對(duì)原料豆粕進(jìn)行發(fā)酵處理后的產(chǎn)物。發(fā)酵 過(guò)程中可產(chǎn)生蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等多種酶活，其目的就是消除抗?fàn)I養(yǎng) 因子，把大分子量的大豆蛋白質(zhì)分解為多肽、寡肽、小肽，從而增加水溶性，提高消化 率，利于動(dòng)物消化吸收。這些酶把纖維類物質(zhì)分解為糖，部分糖被轉(zhuǎn)化為乳酸，并產(chǎn)生 大量有益微生物，使豆粕轉(zhuǎn)化成高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的功能性飼 料。發(fā)酵豆柏可替代日糧中血漿蛋白粉、魚(yú)粉、腸膜蛋白和乳清粉等動(dòng)物性飼料原料，可替代日糧中控制腹瀉的預(yù)防性抗生素，大大降低生產(chǎn)成本，減少畜禽養(yǎng)殖對(duì)動(dòng)物性飼料原料的依賴，杜絕動(dòng) 物性飼料原料所帶來(lái)的疾病傳播，提高養(yǎng)殖業(yè)的安全與效益。大豆的抗?fàn)I養(yǎng)因子有蛋白

3、酶抑制因子（protease inhibitors大豆凝集素（SBA、大豆抗原、非淀粉多糖（NSP、植酸（Phytic acid、單寧、大豆寡糖、脲酶、.大豆異黃酮、大豆皂甙、致甲 狀腺腫因子、生氰糖甙等。這些抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)導(dǎo)致人和動(dòng)物 胰腺腫大、過(guò)敏反應(yīng)、生長(zhǎng)緩慢、日糧 養(yǎng)分利用率下降以及其他一些不良生理反應(yīng)。本試驗(yàn)測(cè)定起主要抗?fàn)I養(yǎng)作用的胰蛋白酶抑制因子、凝集素及大豆抗原中的 大豆球蛋白和B 一伴大豆球蛋白。1材料與方法1.1腮酶的測(cè)定脲酶活性測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB8622-88執(zhí)行。1.2胰蛋白酶抑制因子（TI的測(cè)定方法發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子的測(cè)定，參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T110

4、3.2-2006,轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全檢測(cè)抗?fàn)I養(yǎng)素第2部分:胰蛋白酶抑制劑的測(cè)定。其原理是，胰蛋白酶可作用于底物苯甲酰一 L精氨酸對(duì)硝基苯胺 （隊(duì)PA結(jié)構(gòu)中精氨酸與對(duì)硝基苯胺的連接鍵，釋放出黃色的對(duì)硝基苯胺,該物質(zhì)在410hm有最大吸收值。大豆及其產(chǎn)品中的胰蛋白酶抑制劑可抑制這 一反應(yīng)，使吸光度 值下降，其下降程度與胰蛋白酶抑制劑活性成正比。用分光光度法 在410hm處測(cè)定吸光度值的變化，可對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性進(jìn)行定量分析。1.3凝集素的測(cè)定方法發(fā)酵豆粕凝集素的測(cè)定，參照戴大章 <飼料中植物凝集素的快速檢測(cè)方法 >中的方法進(jìn)行，其原理是，凝集素具有凝集兔、人等的紅細(xì)胞的能力，

5、細(xì)胞凝集作用是凝 集索與細(xì)胞表面的糖分子結(jié)合 在細(xì)胞表面形成許多交叉的 橋”的結(jié)果。凝集活力（效價(jià)與凝集素的量成線性關(guān)系。因此，利用凝血反應(yīng)測(cè)定其血凝活力，通過(guò)比較標(biāo) 準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的血凝活力，可以定量檢測(cè)凝集素含量。1.4B 一伴大豆球蛋白（B Conglycinin和大豆球蛋白（Glycinin測(cè)定方法B-Conglycinin,目前多數(shù)人認(rèn)為這是相對(duì)分子量為 180kDa的三聚體，是7S的主 要組分，由三個(gè)亞基（a 7、0、B組成?？捎肧DS-PAGE凝膠電泳使其變性，從而將其 單體亞基分開(kāi)。大豆球 蛋白（Glycinin,是純化的11S大豆球蛋白，目前認(rèn)為其是相對(duì) 分子量為360kDa

6、的六聚體,其單聚體亞基的結(jié)構(gòu)為A-S-S-B,A和B都是酸性多肽， 但分子量不同,S-S為二硫鍵，將A和B連接起來(lái)。B 一巰基乙醇（B 一臟等還原劑可 將Glycinin的亞基和多肽分開(kāi)幢1。測(cè)定這兩者的方法是，用Tris-HCl提取,然后進(jìn) 行SDS-PAGE凝膠電泳，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker,定性檢驗(yàn)其在發(fā)酵豆粕中存在的 情況。1.4.1抗原蛋白抽提稱取過(guò)60目的發(fā)酵豆粕1.OOg,向其中加入20.OmlO.03mol/L的Tris-HCl（pH8.0,包括0.Olmol/L B 一疏基乙醇，在室溫下于搖床上（100r/min浸提1h,然后 在10000r/min、20 E條 件下離心2

7、0min后，取上清液。此上清液為11S與7S的球蛋 白混合液。142試劑配制丙烯酰胺30%單體貯液:稱取丙烯酰胺29.19，甲叉雙丙烯酰胺0.99,于250mi燒 杯中，向燒杯中加入約80ml滅菌去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓訙缇ルx子水將溶液定 容至lOOml,棕色瓶4度冰箱保存。分離膠緩沖液貯液1.5M Tris-Hcl（pH8.8:稱量18.169Tris置于250Inl燒杯中，加入滅菌水約80ml,充分?jǐn)嚢枞芙?用6M鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8,將溶液定容至lOOml,4度冰箱保存。濃縮膠緩沖液貯液1.OM Tris-Hcl（pH6.8:稱量12.129Tris置于250mi燒杯中，加入約80

8、ml滅菌水充分?jǐn)嚢枞芙?，?M鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，將溶液定容至毫100m1.4度冰箱保存IO%SDS溶液:稱量lOg SDS置于200ml燒杯中，加入lOOmI滅菌水溶解，室溫保存。10%過(guò)硫酸銨：稱取Ig過(guò)硫酸銨，加入9mi去離子水后攪拌溶解，貯存于4度冰箱中。5*Tris-Glycine Buffer（電極緩沖液：稱量下列試劑于1L燒杯中:Tris15.19,Glycine（甘 氨酸949,SDS 5.Og加入約800ml去離子水，攪拌溶解，加去離子水 將溶液定容至lL,室溫保存。樣品緩沖液（0.踟 Tris-Hcl,pH6.8:1.6IIIl濃縮膠緩沖液貯液（1伽Tris-Hcl,p

9、H6.8,4ml IO%SDS,Iml 8 一巰基乙醇,2.5ml甘油,0.19溴酚藍(lán)，轉(zhuǎn)移到20ML容量瓶，加去離子水定容到刻度。染色液:稱取0.59考馬斯亮蘭P,250,加125mi異丙醇溶 解，加50ml冰醋酸攪拌均勻，再加325mi去離子水?dāng)嚢?，然后用快謎定性濾紙過(guò)濾.室溫保存。脫色液:取50ml冰醋酸,25ral無(wú)水乙醇,42鈿1去離子永，混合均勻，室溫保存。I t3不連墟Y OS-P性黜電泳的濃縮腔和分離腔的材取按下表比例配制分離腔與濃縮膠表I 1羈升高睨和鼴濃縮膠配制144電泳將提取液與樣品緩沖液以i:l的比例混臺(tái)后，在100度水浴鍋中煮5min取30u1, 點(diǎn)樣到制作 好的電泳

10、板上。雖白質(zhì) Marker的用量參照其說(shuō)明書(shū).內(nèi)外均加八一樣的電極緩沖癟開(kāi)始以80V電壓電泳,持溴酚藍(lán)條帶進(jìn)入分離脞后，加大電壓到120V, 溴酚藍(lán)到底部上約0501處結(jié)柬電泳。145染色、脫色和照相將電泳后的膠板移A染液中.在轉(zhuǎn)速為40 60r/rain的搖床上染色2h后,轉(zhuǎn)到脫色液中浸泡過(guò)夜，期間更換2-3狄脫色藏,至電林條帶清晰為止。用數(shù)碼相機(jī)拍攝凝 膠照片，記錄井保存。2結(jié)果與分析21量舌性8種發(fā)酵豆粕的腮薛活性均為0。22胰蛋白一抑崩囚于和疆墓素用上述方法測(cè)定了 8種發(fā)酵豆粕胰蛋白酶抑制園子及凝集素，古量糧低.均未檢23大豆抗原用8種發(fā)酵豆粕和一種普通豆粕.做了電泳，圖片如下:其中條

11、帶5是普通豆粕,9是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker,其余是發(fā)酵豆粕，標(biāo)準(zhǔn)物分子量條帶如圖 標(biāo)注所示,在一定條件下，蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率問(wèn)的關(guān)系，可 用下式表示:MW=K(10 一 hIgl 哪=lgK bnh=KI bml式中:唧為蛋白質(zhì)的分子量:K,K。為常數(shù);b為斜率;咖為相對(duì)遷移率測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)物各條帶到加樣口的距離，而得到分子量與遷移率的相關(guān)方程為：y= 1.3275x+2.5002（r=0.99從而算出7S和1IS的幾個(gè)亞基的分子量如下表 2, 同樣也把Maruyama（1998和李德發(fā)（2003所研究的幾個(gè)亞基的分子量列在表中，用以 對(duì)照。表2五個(gè)亞基的分子量表從圖上可見(jiàn)，1、3、

12、4、6、7、8號(hào)樣品，幾個(gè)亞基消失，說(shuō)明大豆抗原已經(jīng)完全分 解,2號(hào)和10號(hào)樣品，兩種抗原的條帶清楚，說(shuō)明抗原存在，發(fā)酵不徹底。3討論3.1腮酶活性（UA尿酶活性測(cè)定值是傳統(tǒng)的用以鑒定豆柏加熱程度的指標(biāo)。尿酶本身無(wú)營(yíng)養(yǎng)意義 但它與胰蛋白酶抑制因子的含量接近，而且遇熱變性失活的程度與胰蛋白酶抑制因 子相似。在一定范圍內(nèi)，脲酶活性與胰蛋白酶抑制因子的含量具有強(qiáng)相關(guān)性，測(cè)定脲酶活性可以間接地反映胰蛋白酶抑制因子的含量。但尿酶沒(méi)有負(fù)值.它對(duì)任何過(guò)熟豆粕的最低值均顯示為零，而此時(shí)胰蛋白酶抑制因子未必為零，因此測(cè)定脲酶活性是 不夠的，還需要測(cè)定胰蛋白酶抑制因子才行。3.2發(fā)酵豆粕胰蛋白酶抑制因子和凝集素含

13、量在一定的范圍內(nèi)，隨著大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子的受熱鈍化。大豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到改 善。在大豆抗?fàn)I 養(yǎng)因子中，胰蛋白酶抑制因子、脲酶和大豆凝集素是熱敏性抗?fàn)I養(yǎng)因子,對(duì)熱比較敏感。常壓蒸汽 處理，溫度不超過(guò)100C,蒸汽加熱30min,胰蛋白酶抑 制因子活性可降低90%仇）。Oin（1996報(bào)道,當(dāng)生大豆通入蒸汽，120C加熱7.5min時(shí), 胰蛋白酶抑制因子的含量可由20.6mg/g下降到3.3mg/g T。秦貴信（1995報(bào)道，常壓 蒸汽102C ,20min,胰蛋白酶抑制因子下降88%,而40min則下降92%, 60min,全部消 失哺1。與胰蛋白酶抑制因子相比，大豆凝集素對(duì)高溫更為敏感，這是由于大

14、豆凝集素是 一種糖蛋白，具有不可逆轉(zhuǎn)變性特點(diǎn)，較容易失活。Qin（1996報(bào)道1,102"。加熱20min,大豆凝集素的存留率只 有1.4%,當(dāng)溫度提高到。提高到120C ,只要1.5min就完全失去活性.采用濕熱處理,190"C加熱1060秒就可以完全失活。于平等（2001m1報(bào)道，濕熱處理，加熱到80C .凝集素活性無(wú)明顯變化,7595°C加熱25min才開(kāi)始明顯下降，95°C加熱35min或120°C加熱15min,其活性 可以完全喪失。目前發(fā)酵豆粕是用固體發(fā)酵方法生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝流程是：豆粕加水 拌勻、蒸煮、接種、發(fā)酵、后熟干燥、磨粉、

15、包裝。其中蒸煮滅菌是，在常壓下、 溫度100C左右，進(jìn)行蒸煮約30min,這可以使絕大部分胰蛋白酶抑制因子和凝集素 失去活性。胰蛋白酶抑制因子本身是一種蛋白質(zhì)，可以被蛋白酶水解成更簡(jiǎn)單的多肽，活性 隨著酶解反應(yīng) 的進(jìn)行,而逐步喪失。Laskowski等（1974盯1發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶和枯草桿 菌蛋白酶能特異性地將KTI水解成多肽，降低其活性。楊曉泉呻1等（2001研究發(fā) 現(xiàn),在一定條件下，堿性內(nèi)切蛋白酶（alcalase可同時(shí)降解大豆蛋白和胰蛋白酶抑制因子，其中胰蛋白酶抑制因子可被鈍化 8096。Huo等舊1(1993用五種來(lái)源于細(xì)菌和真 菌的蛋白酶進(jìn)行了生大豆(RS和低溫膨化全脂大豆粉(LTES

16、中的胰蛋白酶抑制 因子 和凝集素的體外鈍化試驗(yàn)，結(jié)果表明,它們都不同程度地鈍化抗?fàn)I養(yǎng)因子，其中一種來(lái) 源于細(xì)菌的蛋白酶分別鈍化生大豆中62%的胰蛋白酶抑制因子和91%的糜蛋白酶 抑制因子(CIA 0由此可見(jiàn),發(fā)酵豆粕生產(chǎn)過(guò)程中，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子源于兩個(gè)方面，一是蒸煮過(guò)程, 是發(fā)酵過(guò)程。蒸煮滅菌后，值入的菌體一般是乳酸，酵母、芽抱桿菌屬、曲霉菌屬等， 會(huì)分泌許多酶作用于抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而降低其活性。這兩方面共同作用，導(dǎo)致發(fā)酵豆 粕中的胰蛋白酶抑制因子和凝集素 被分解和鈍化,含量極低或被完全分解，從而檢不 出。3.3大豆抗原含量到20世紀(jì)末期，人們已認(rèn)識(shí)到日糧抗原過(guò)敏反應(yīng)是斷奶后腹瀉的先決條件，因此大

17、豆抗原是否已經(jīng)分解，是決定發(fā)酵豆粕質(zhì)量的是一個(gè)重要的指標(biāo)。Maruyama等 (1998,研究認(rèn)為B 一伴大豆 球蛋白是一種三聚體蛋白質(zhì)，分子量范圍為150200kDa,由三種亞基組成:a ' f71kDa,a (-一 67kDa,和8(-50kDa,所有的亞基都是N 糖基化的。由對(duì)照樣品普通豆粕分子量和遷移率方程可計(jì)算出，其三個(gè)亞基Q。、Q、B 的分子量分別是72.3、68.6,52.7kDa,與Maruyama研究結(jié)果很相近。大豆球蛋白(Glycinin,是純化的11S大豆球蛋白，目前認(rèn)為其是相對(duì)分子量為360kDa的六聚體，其單聚體亞基的結(jié)構(gòu)為 AS-s B,A和B都是酸性多肽,

18、但分子 量不同，分別為3444kDa和20kDa,S-s為二硫鍵將A和B連接起來(lái)心1。也從上述方程中可知，普通豆粕的A、B亞基的分子量 分別是38.4kDa和20.4kDa也與這 結(jié)果相近。在8種發(fā)酵豆粕的圖譜中，我們可以看出2號(hào)樣品有B 一伴大豆球蛋白中的Q7a兩個(gè)亞基存在，8號(hào)樣品有B亞基存在,10號(hào)樣品有大豆球蛋白的 A、B亞基，其它樣品均無(wú)這兩種抗原的亞基,也即均已在發(fā)酵中分解為多肽或更小分子量的肽。也說(shuō)明發(fā)酵，能在一定程度上分解了大豆抗原。 可以嘗試在斷奶仔豬飼料中多使用 發(fā)酵豆柏。3.4抗?fàn)I養(yǎng)因子測(cè)定種類的確定各種抗?fàn)I養(yǎng)因子在大豆中的含量各不相同，且抗?fàn)I養(yǎng)作用興有差異。總體上看，

19、大豆蛋白酶抑制因子、凝集素和植酸等的抗?fàn)I養(yǎng)作用較強(qiáng)，而抗維生素因子和皂甙 等的抗?fàn)I養(yǎng)作用較弱.有些甚 至沒(méi)有抗?fàn)I養(yǎng)作用，而主要作為生物活性物質(zhì)。蛋白酶 抑制因子，主要指Kunitz(庫(kù)尼茲胰蛋白 酶抑制因子(KTI和鮑曼一伯g蛋白酶抑制因子(Bolmmn-Birk,BBI,前者主要在大豆中，而后者主要在豌豆和菜豆中。Liener(1996研究報(bào)道硼,在生大豆對(duì)大鼠生長(zhǎng)抑制作用方面，大豆凝集素76的貢獻(xiàn)率為5 0%，胰蛋白酶抑制因子(KTI )為4 0%，而其它抑制因子 僅為10%。大量的研究表明，斷 奶仔豬飼糧中的抗原引起腸道的短暫過(guò)敏反應(yīng) 是斷奶后腹瀉的決定因素。大豆中存在的抗原物質(zhì)能 引起

20、仔豬腸道過(guò)敏和損傷， 進(jìn)而引起腹瀉。已證實(shí)，引起斷奶仔豬過(guò)敏反應(yīng)的主要抗原是大豆球蛋白和B 伴大豆球蛋白。由此可見(jiàn)。只需測(cè)定這三者即可。其他的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低，不構(gòu) 成抗?fàn)I 養(yǎng)作用，不必測(cè)定。4小結(jié)和展望4.1大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子中胰蛋白酶抑制 因子、凝集素和大豆抗原，抗?fàn)I養(yǎng)作用最強(qiáng)，在抑制動(dòng)物生長(zhǎng)中，凝集素貢獻(xiàn)率是5 0%，胰蛋白酶抑制因子是4 0%。而大豆抗原中8伴大豆球蛋白和大豆球 蛋白，是引起斷奶仔豬過(guò)敏反應(yīng)而導(dǎo)致腹瀉的主要抗原。4.2測(cè)定8種發(fā)酵豆粕，脲酶活性均為O,胰蛋白酶抑制因子和凝集素含量極低未檢出。用用SDS P AGE凝膠電泳定性檢測(cè)大豆抗原中的13伴大豆球蛋白(B-Cong l

21、ycin in)和大豆球蛋白(Glycini n)，結(jié)果表明，僅兩種有抗原存在，其余均分解鈍化，說(shuō)明絕大部分發(fā)酵豆柏在發(fā)酵中已經(jīng)完全鈍化分解了所有的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子。生物發(fā)酵是一種有效的鈍化消除大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子的方法。參考文獻(xiàn)1戴大章.飼料中植物凝集素的快速檢測(cè)方法 一一血凝法.飼料研 究.J 2 0 0 3,1:3 52李德發(fā).大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子M.北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社.2 0 0 3:1 4 0.3李德發(fā).大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子M.北京；中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社.2 0 0 3:1 8 9.4lOln bred G.P rocesslng soyabeans of dlfferentr gins.Response of to a Chlnese and awese rnplg dletary lncuslon:dlssertatln.1996.Wagenlngen,TheNetherland:Wa gennlngen Agrlcultural unlverslt y. 5秦貴信.熱處理對(duì)不同來(lái)源大豆的蛋白質(zhì)擴(kuò)散性和胰蛋白酶抑制因子6活性的影響.第二屆全國(guó)飼 料營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集.1 9 9 5:4 9.于平，勵(lì)建榮，顧振宇等.去除大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子的研究.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2 0 0 2,23 (4):383 385.7Laspkowskl M.Evaluatlon of speclal lt